一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法

摘要

本发明公开了一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：1）菌种活化；2）植物材料准备；3）预培养；4）侵染；5）共培养；6）洗叶片；7）愈伤诱导；8）芽诱导；9）根诱导培养。本发明的方法提高了蓝莓转基因效率，转化率可达到10%以上。将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对蓝莓叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。

主权项

一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌AGL0在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2‑3个，接种到50 mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3之间；2）植物材料准备：取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35～40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段；3）预培养：将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片；4）侵染：预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40 分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；5）共培养：侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25 ℃培养箱中黑暗培养3 天；6）洗叶片：因此共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分；7）愈伤诱导：清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基；8）芽诱导：将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基；9）根诱导培养：抗性植株长到大约2‑3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。