一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法

摘要

本发明涉及一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法，该方法首先构建带有亲和标签的类泛素修饰结合酶与类泛素修饰蛋白融合基因表达质粒，然后将所述融合基因表达质粒转染到真核细胞中，48或72小时后收集细胞并裂解，获得全蛋白裂解液，通过亲和标签分离纯化类泛素修饰蛋白底物，进一步通过胰蛋白酶酶解类泛素修饰蛋白底物，提取纯化多肽，利用质谱分析鉴定修饰底物多肽，搜索数据库获得多肽序列，比对对照样品和修饰底物的分子量变化最终确证类泛素修饰蛋白底物，本发明通过表达类泛素修饰结合酶和类泛素修饰蛋白的融合蛋白来提高类泛素修饰蛋白对底物蛋白的修饰程度，并通过亲和层析提高对底物蛋白的分离效率，可更可靠地确证类泛素修饰蛋白的底物。

主权项

一种类泛素修饰蛋白底物鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)构建类泛素修饰结合酶与类泛素修饰蛋白融合基因表达质粒，所述融合基因表达质粒5’端引入一个带亲和标签的核苷酸序列；(2)转染融合基因表达质粒到真核细胞，收集该真核细胞并用细胞裂解缓冲液裂解，获得全蛋白裂解液；(3)采用亲和树脂从上述全蛋白裂解液中纯化富集类泛素修饰底物蛋白；(4)采用十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)对经上述纯化富集所得的类泛素修饰底物蛋白进行分离，并对分离所得不同分子量的蛋白条带进行酶切反应，并提取纯化底物多肽；(5)质谱分析修饰蛋白底物多肽；(6)搜索蛋白数据库获得多肽与蛋白序列，根据对照样品和修饰底物的分子量差异确证类泛素修饰蛋白底物。