一种诱导三分三毛状根的方法

摘要

本发明公开了一种诱导三分三毛状根的方法，主要提供了通过发根农杆菌介导的三分三毛状根诱导技术。具体涉及发根农杆菌的活化、转化菌液的制备、外植体的转化、毛状根的继代培养及毛状根的PCR检测等方法。本发明通过三分三毛状根的高效诱导和规模化培养，可实现托品烷类生物碱的工厂化生产，对三分三这一珍稀药用植物资源的可持续利用具有重要意义。

主权项

一种诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：利用发根农杆菌侵染三分三种子萌发，获得的无菌苗叶片，诱导三分三叶片愈伤组织产生毛状根，以获取托品烷类生物碱；具体步骤如下：步骤1：活化发根农杆菌A4菌株，制备OD₆₀₀=0.6～0.8的转化菌液；步骤2：将经过预培养的外植体在转化菌液中浸染2～5 min后，接种到共培养基上，置于温度为23～27℃的恒温培养箱中暗培养3～5 d；步骤3：将所述步骤2中共培养的外植体接种到抑菌培养基上，置于23～27℃的恒温培养箱中暗培养，直至外植体上愈伤组织产生毛状根；步骤4：剪取毛状根接种于脱菌培养基上暗培养1～3周，选取生长快、分支好的毛状根每2～4周继代一次，头孢霉素Cef的浓度逐渐降低直到完全脱菌；步骤5：配制含rolB基因序列特异性引物的PCR反应体系，提取所述步骤4中获得的无菌三分三毛状根DNA进行PCR分子检测，以确定三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。