一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法

摘要

本发明提供了一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，所述方法包括胎盘组织的获得、胎盘组织的粗剪、胎盘组织细胞分离、内皮祖细胞洗脱、内皮祖细胞浓缩纯化五个步骤，所述方法和使用的设备简单，操作方便，洗脱出来的内皮祖细胞损伤小，数量多，纯度高，增殖能力强，可以用于临床的移植和对受损血管的修复。

主权项

一种从胎盘中洗脱内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法具有胎盘组织的获得、胎盘组织的粗剪、胎盘组织细胞分离、内皮祖细胞洗脱、内皮祖细胞浓缩纯化的步骤，其分别为：（1）胎盘组织的获得：胎盘灌洗造血干细胞后，将胎盘再次消毒处理后转移到无菌操作台，在靠近胎盘上脐带的位置，剪下胎盘胎儿侧，注意不要剪到母亲一侧的组织；（2）胎盘组织的粗剪：将从胎盘上剪下的组织块放置于离心管中，用消毒灭菌的剪刀，将胎盘组织剪成大小5 mm的小块；（3）胎盘组织细胞分离：将切成小块的胎盘组织转移到含有5 mL PEB缓冲液的gentle MACS的C管中，使用全自动组织处理器处理胎盘组织；（4）内皮祖细胞洗脱：将步骤（3）处理后的组织，用洗脱液从gentle MACS的C管中冲洗出来，置于新的50 mL离心管中，加洗脱液到40 mL，然后关紧瓶盖，轻轻摇动离心管成细胞悬液，去除大的组织块，将70 μm的细胞过滤网放置于50 mL离心管上，将细胞悬液通过细胞过滤网；所述洗脱液的配制是：DMEM/F12培养液中加入胎牛血清（FBS）、硝酸甘油、肝素钠、AMD3100和白蛋白，FBS的浓度是10%，硝酸甘油的浓度是15‑20 mg/L，肝素钠的浓度是50‑75单位/mL，AMD3100的浓度是5‑10 mg/L，白蛋白的浓度为38‑54 g/L；（5）内皮祖细胞浓缩纯化：将过滤后收集的细胞悬液和淋巴细胞分离液按2：1‑1：2的比例添加到离心管中，先在离心管中加淋巴细胞分离液，保持淋巴细胞分离液液面平整，再缓慢加入细胞悬液，2200‑2500 rpm离心20‑25分钟，离心时慢加速慢减速，离心结束后，收集中间白膜层，生理盐水离心清洗两遍，内皮祖细胞进行流式细胞仪检测和内皮祖细胞成血管实验。