一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用

摘要

本发明公开了一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其构建方法，并提供了其在弧菌基因敲除中的应用方法。基因敲除自杀载体pLP12，为环状载体，包括P_BAD启动子、阻遏蛋白基因araC、RP4转移起始位点、氯霉素抗性基因、R6K复制起始位点、多克隆位点区和致死基因vmi480，所述的多克隆位点区至少包含两个AhdI酶切位点，自杀载体pLP12经AhdI酶切后形成线性化自杀载体pLP12T。本发明的基因敲除自杀载体中采用了全新的反向选择基因vmi480，用于替代常用的sacB基因。pLP12T携带外源片段通过接合方式转移到待突变弧菌细胞，在抗生素以及反向选择致死基因vmi480产物压力下，弧菌先后发生第一次同源重组和第二次同源重组，最终产生目的基因缺失突变株。

主权项

一种基因敲除自杀载体pLP12，为环状载体，其特征在于，包括P_BAD启动子、阻遏蛋白基因araC、RP4转移起始位点、氯霉素抗性基因、R6K复制起始位点、多克隆位点区和致死基因vmi480，所述的多克隆位点区至少包含两个AhdI酶切位点，所述的致死基因vmi480的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第21‑617位碱基序列所示，所述的致死基因vmi480位于P_BAD启动子下游并处于P_BAD启动子控制之下。