重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法

摘要

本发明公开了一种重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，该方法以蛔虫成虫虫体或者感染性虫卵的RNA为模板，利用RT-PCR扩增出ALAg基因，构建ALAg表达载体并转化表达菌进行诱导表达，纯化重组蛋白，以纯化蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测方法。本发明建立了稳定而特异的抗蛔虫体IgG的间接ELISA检测方法，可用于蛔虫感染的临床监测和诊断，适宜在基层和临床广泛推广。

主权项

一种非疾病诊断或治疗目的的重组蛔虫ALAg蛋白抗原检测抗蛔虫抗体间接ELISA方法，其特征在于，按照下列步骤进行：（1）重组蛔虫ALAg蛋白抗原的制备①蛔虫成虫总RNA的提取和RT从‑70℃冰箱取出蛔虫成虫虫体或感染性虫卵，置于研钵中磨成粉末，然后按RNA提取试剂盒说明提取总RNA，以抽提的总RNA为模板，反转录为cDNA；②ALAg基因的扩增和克隆以cDNA为模板，根据Genbank中公布的猪蛔虫抗原基因的序列，利用Primer Primer 5.0软件设计引物进行扩增蛔虫的ALAg基因，所述引物中，上游含BamH I酶切位点引物为：5’‑CGCGGATCC GCCAGTTTAAGCGAGATGC‑3′；下游含EcoR I酶切位点引物为：5’‑CCGGAATTCGAGAAGCTTATGCCTCGCTT‑3'；扩增产物用DNA胶回收试剂盒回收ALAg目的片段；将ALAg与pMD18‑T载体连接，然后转化感受态细胞DH5α，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落经过菌落PCR鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒pMD18‑T‑ALAg进行测序；③Pet28a+‑ALAg重组质粒构建及酶切鉴定将测序正确的阳性菌，提取质粒pMD18‑T‑ALAg，分别采用BamH I和EcoR I进行酶切pMD18‑T‑ALAg质粒和Pet28a+表达载体，纯化目的片段进行连接成Pet28a+‑ALAg，并转入DH5α中，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上进行培养，挑取菌落经过菌落PCR和酶切鉴定后，抽提鉴定为阳性的菌株进行提取质粒Pet28a+‑ALAg进行测序；④重组Pet28a+‑ALAg质粒在大肠杆菌中的诱导表达将测序正确的阳性质粒Pet28a+‑ALAg转化BL21‑DE3感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达；⑤重组ALAg蛋白的纯化按l: 100比例将培养过夜的含有Pet 28a+‑ALAg的BL21‑DE3接种到新的LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至细菌生长对数中期，A550=1.0；在IPTG诱导下，进行重组ALAg蛋白的大量表达，收集诱导表达菌；离心后将细菌沉淀经反复冻融和超声裂解后，依次用含0、2、4 mol/L尿素的1×结合蛋白缓冲液洗涤沉淀；随后用含8mol/L尿素的l× 结合蛋白缓冲液重悬沉淀，冰上放置l h，使包涵体蛋白完全溶解；16, 000×g离心30min去除不可溶物，以孔径0.45mm 的NC膜过滤收集上清液；经His结合树脂纯化，以缓冲液洗去杂蛋白，以洗脱液洗脱重组ALAg蛋白；将纯化的重组蛋白于4℃分别在含4mol/L、2 mol/L尿素的PBS及PBS溶液中依次进行透析，将溶液进行冷冻干燥后于4℃保存；（2）以纯化后的重组ALAg蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法①最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定将重组ALAg蛋白用pH 为9.6的0.05M的碳酸盐稀释成为25、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL 6个浓度包被酶标板100 μL /孔，每个浓度包被1列，于37℃温浴1 h后放置于4℃过夜，取出用含0.05% Tween‑20的PBS‑T洗涤3次，每次3 min，然后每孔再加1% 牛血清白蛋白（BSA）100 μL封闭液，37℃封闭30 min；然后将已知蛔虫阳性血清和蛔虫阴性血清在酶标板上从1：20、1：40、1：80、1：160和1：320倍比稀释，分别加入上述已封闭的酶标板中，100 μL/孔，37℃反应1 h后，洗涤3次，用封闭液作1: 8000稀释辣根过氧化物酶标鼠抗人IgG加入上述已封闭的酶标板，100 μL/孔，37℃ 反应1 h，经洗涤后加入TMB底物溶液 100 μL/孔，反应15 min，最后加入100 μL 2 mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在490 nm波长下测定OD值，同时用健康人血清作方阵滴定；选择已知蛔虫阳性血清与蛔虫阴性血清OD₄₉₀的P/N比值最大所对应的抗原、抗体稀释度作为判定标准；②鼠抗人IgG‑HRP的最佳工作浓度的确定将鼠抗人IgG‑HRP作1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000和1:16000倍比稀释，通过检测已知阳性和阴性血清，来确定鼠抗人IgG‑HRP的最佳工作浓度；③间接ELISA 方法建立将重组ALAg蛋白以最佳包被浓度包被酶标板100 μL /孔，于37℃过夜，洗涤3次，每次3 min，晾干；加入100 μL/孔封闭液，37℃温浴1 h，然后将待检血清按步骤（2）的步骤①中试验结果得出的最佳稀释倍数稀释后加入酶标板100 μL/孔，37℃ 温浴1 h，洗涤 3 次，晾干，加入步骤（2）的步骤②试验结果得出的最佳工作浓度的鼠抗人IgG‑HRP 100 μL/孔，37℃ 温浴1 h，洗涤3次，每次 3 min，晾干，加入TMB底物100 μL/孔，37℃反应15 min，最后加入100μL 2 mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测OD₄₉₀值。