一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法

摘要

本发明涉及一种从免疫球蛋白G的木瓜蛋白酶解液中纯化Fc片段的方法，属于Fc片段纯化方法技术领域。本发明主要解决现有蛋白A亲和层析存在介质成本昂贵，寿命周期较短，蛋白质类型的配基易脱落，污染待纯化抗体，洗脱条件较苛刻，容易对抗体造成伤害等问题。本发明一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法，包括以下步骤：(1)采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，(2)木瓜蛋白酶水解IgG，(3)采用混合模式层析填料MEP HyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液。本发明具有配基稳定、再生容易、可多次重复使用、洗脱条件温和、不易引起产物结构变异、无需后续操作等优点。

主权项

一种用混合模式层析填料制备免疫球蛋白G Fc片段的方法，其特征是包括以下步骤：(1)采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆采用MEP HyperCel混合模式层析填料处理人血浆，获得免疫球蛋白IgG，首先使用平衡液A平衡装有MEP HyperCel层析填料的层析柱，平衡至层析柱流出液pH值与平衡液A相同，再取人血浆低速离心后除去悬浮物，用平衡液A稀释至3倍体积后，直接上样于平衡后的层析柱，上样后用平衡液A冲洗层析填料中未结合的成分,然后使用洗脱液A进行洗脱，并收集洗脱组分，洗脱完毕后采用0.1mol/L氢氧化钠对层析柱进行在位清洗，之后再使用平衡液A平衡层析柱，其中所述平衡液A为三羟基氨基甲烷‑盐酸或磷酸盐缓冲液，pH值为7～8，浓度不大于0.2mol/L，所述洗脱液A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液，pH值为4.0～5.0；(2)木瓜蛋白酶水解IgG更换缓冲液：将洗脱组分置于超滤管中，加入体积等体积的酶解缓冲液进行超滤浓缩，重复5次，收集最后一次超滤组分，完成更换IgG缓冲液，；其中酶解缓冲液组成为：25mmol/LNaH₂PO₄‑50mmol/L NaCl，pH值为7.2，木瓜蛋白酶水解IgG：在木瓜蛋白酶溶液中，分别加入四乙酸乙二胺和巯基乙醇，使溶液中四乙酸乙二胺和巯基乙醇的终浓度分别为4mmol/L和20mmol/L，并维持15分钟使木瓜蛋白酶充分活化，然后将活化的木瓜蛋白酶加入最后一次超滤组分缓冲液中进行酶切反应，结束后加入过氧化氢终止反应，制成IgG的木瓜蛋白酶解液，过氧化氢在反映体系中的终浓度介于0.8～1％，木瓜蛋白酶与IgG的质量比≥1:20，酶切反应时间大于等于8小时；(3)采用混合模式层析填料MEP HyperCel处理IgG的木瓜蛋白酶解液将IgG的木瓜蛋白酶解液离心，除去悬浮物，上样于经平衡的MEP HyperCel层析柱，上样完成后采用平衡液B冲洗，再用洗脱液B洗脱，洗脱组分即为纯化的IgG Fc片段，洗脱结束后用0.1mol/L氢氧化钠溶液清洗层析柱料，所述平衡液B的组成为：25mmol/L Tris‑HCl‑50mmol/L NaCl pH为7.0±0.4；洗脱液B的组成为：100mmol/L三羟基氨基甲烷‑醋酸‑50mmol/L NaCl，pH为4.5±0.1。