一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒以其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒及其制备方法。液相芯片主要包括有：分别包被了氧化性低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）、可溶性CD40配体（soluble CD40 ligand, sCD40L）、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9, MMP-9）、组织因子（tissue factor, TF）、网膜素（omentin）和内源性可溶性RAGE（endogenous secretory receptor of advanced glycation end products, esRAGE）捕获抗体的微球；生物素标记的检测抗体以及链亲和素藻红蛋白。本发明所提供的液相芯片具有检测效率高、所需样本量少、特异性强、灵敏度高、检测快速准确等优点。同时，该芯片同时反映了机体内保护性和损伤性因素水平的高低，以便更全面综合评估患者的危险分层和预后情况。同时本发明的制备方法简单易行，稳定性好，其技术方案中的各种工艺参数如微球和抗体的量、反应过程等均是在大量实验基础上得出的，为制备过程最佳的参数值。

主权项

一种用于急性冠脉综合征的液相芯片试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括有如下步骤：1）按照上述试剂盒的组成，制备相应的抗体包被微球：分别选取不同的微球，经涡旋或超声悬浮20‑25秒；活化微球的步骤如下：用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球；取50μl微球离心收集沉淀，离心条件为≥8000g ，离心1‑2分钟；去掉上清液，将微球悬于100μl的双蒸水中，用涡旋振荡器或者超声波悬浮微球20‑25秒，离心收集沉淀，离心条件为≥8000g，离心1‑2分钟；吸弃上清，加入80μl的磷酸盐缓冲液、pH6.2；涡旋振荡20‑25秒，超声波悬浮微球20‑25秒；加入10μl 50mg/ml的N‑羟基硫代琥珀酰亚胺（S‑NHS），用涡旋振荡器轻轻地混匀；加入10μl 50mg/ml的1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），用涡旋振荡器轻轻地混匀；室温避光静置20min，每10分钟使用涡旋振荡器轻轻地混匀；50μl微球活化后，离心条件为≥8000g，离心1‑2分钟；吸去上清，将微球重悬于250μl 50mM的MES的溶液中，涡旋25‑30秒，超声25‑30秒，离心收集活化后的微球，离心条件为≥8000g，离心1‑2分钟；重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于100μl 50mM的MES的溶液中，涡旋25‑30秒，超声25‑30秒，加入1μg的抗体，用50mM的MES的溶液将总体积补至500μl；经涡旋震荡混匀，室温避光振荡3小时； 离心收集偶联抗体的微球，离心条件为≥8000g，离心2‑3分钟；吸去上清，将微球重悬于500μl的PBS‑TBN溶液中，涡旋25‑30秒，超声25‑30秒，室温避光震荡30分钟，离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1‑2分钟；吸去上清，将微球重悬于1ml的PBS‑TBN溶液中，涡旋25‑30秒，超声25‑30秒，离心收集微球，离心条件为≥8000g，离心1‑2分钟重复该步骤一次；吸去上清，将微球重悬于600μl的PBS‑TBN溶液中，将包被好的微球送往Luminex仪器或流式细胞仪计数；包被好抗体的微球置于2‑8度避光保存，每种抗体偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择等比例混合；50mM的MES缓冲液，pH5.0，500ml配方如下：将购自Sigma公司的MES4.88g溶于450ml双蒸水中，加入事先配置好的0.1M的氢氧化钠溶液调节pH值至5.0，经0.22μm无菌滤器过滤后，4度冰箱备用；PBS配方：将购自Takara公司的PBS片剂10片，溶于1000ml双蒸馏水中，再加入NaCl 8,000 mg，KCl 200 mg，Na₂HPO₄ 1150 mg，KH₂PO₄ 200 mg，高压灭菌后常温备用；PBS‑TBN配方，pH为7.4，将购自Amresco公司的BSA1g，购自Sigma公司的Tween‑20，0.2ml和叠氮钠500mg，溶于购自takara公司的1L配好的PBS溶液，搅拌混匀；2）进行每种检测抗体的生物素标记：依据蛋白浓度计算反应体系：计算将抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，为目标体积V，配制NHS‑Biotin反应液，用DMSO溶解，终浓度为10mg/ml；按摩尔比1：100的比例在反应管中分别加入检测抗体和NHS‑Biotin反应液；加入1/10V的碳酸氢钠溶液，pH8.9；加入PBS溶液补至目标体积；包上铝箔或放入避光暗盒中，将反应管或避光暗盒置于圆周震荡器上，于25度恒温箱中避光孵育5小时，转速为1000rpm；将反应管中的液体转至透析卡中，于1000倍体积的 PBS缓冲液中透析过夜两次，以去除未反应的NHS‑Biotin，测定蛋白浓度；不同的微球指分别包被了ox‑LDL、sCD40L、MMP‑9、TF、omentin及esRAGE捕获抗体的不同微球，上述不同的微球购置于美国Luminex公司。