微小RNA的固相芯片恒温检测方法

摘要

本发明公开了一种微小RNA的固相芯片恒温检测方法，靶分子特异性的上游引物和下游引物，其锚定序列区含有缺口剂识别序列正义链序列，识别序列区则分别与miRNA及其互补链的3'-端序列互补，可在缺口剂和DNA聚合酶协同作用下分别介导一个既独立又相互作用的“切割-延伸-链置换”恒温线性扩增，最终实现恒定温度条件下指数扩增miRNA，通过将荧光报告分子和淬灭分子标记的上游和/或下游引物固定在固相芯片，可通过检测荧光信号实现多种靶分子的高通量检测。本发明克服了miRNA固有属性对其扩增检测方法的设计难度，提供一种基于寡核苷酸引物的液态恒温指数扩增与检测系统，能够在恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增与检测的方法。

主权项

微小RNA的固相芯片恒温检测方法，其特征在于：包括反应混合物，反应混合物包括以下反应成分：①具有3'‑端羟基的miRNA靶分子；②上游引物和下游引物；③DNA聚合酶；④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；⑤三磷酸脱氧核苷酸；⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系；所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5'→3'碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3'‑端序列互补；所述的上游引物和下游引物具有靶分子特异性，每种靶分子特异性的上游引物和/或下游引物通过其5'‑末端固定于固相芯片，并且，固定于固相芯片的上游引物和/或下游引物在其缺口剂识别序列的两侧分别标记具有荧光共振能量转移作用的荧光报告分子和淬灭分子。