胶原蛋白的制备方法

摘要

一种胶原蛋白的制备方法，属于生物食品技术领域。本发明的目的是提供一种以牛皮为主要原料来制备胶原蛋白的制备方法。本发明的胶原蛋白原液的制备步骤是：匀浆消化、吸附过滤、超滤浓缩换缓冲液、离子交换层析、超滤浓缩换保存液、过滤除菌制备胶原蛋白原液，在通过蛋白沉淀、离心、匀浆纤维后获得胶原蛋白。本发明工艺简单，操作容易，经过本发明工艺将牛皮进行处理后获得的浆液用于进行胶原蛋白的提取，能够明显增加胶原蛋白的提纯率和纯度。

主权项

一种胶原蛋白的制备方法，其特征在于：胶原蛋白原液的制备步骤是：       a、匀浆消化：牛真皮组织解冻取冻存的牛真皮组织，加入超纯水浸泡，直到牛真皮解冻成松散的组织颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，成糊状；将糊状的组织颗粒再加入10倍体积的超纯水，按组织捣碎机的操作规程匀浆3次，至完全悬浮；将组织颗粒绞碎均匀后加入超纯水至组织的含量为25克／升，混匀；加冰醋酸至组织悬浮液，调制溶液浓度0.5毫克/毫升；消化：称取胃蛋白酶，将胃蛋白酶溶于0.5M醋酸中制成10mg/ml的胃蛋白酶溶液，然后转入到组织悬浮液至0.1mg/ml，即每100ml匀浆中加入1ml的胃蛋白酶溶液，混匀，室温消化7‑10天；b、吸附过滤：用配置好的10M NaOH标准溶液调节消化液pH至9—9.5，静置过夜，灭活胃蛋白酶；调节pH值：消化液中加入等体积的超纯水,并用浓盐酸调节pH到4.0，搅拌2小时；清洗硅藻土：根据调节pH值后的消化液体积，按浓度为15g/L称取硅藻土，将硅藻土用10mM HCl浸泡2小时，用超纯水清洗数次；吸附过滤：加硅藻土至消化液，混匀，静置 2小时；将滤纸置于过滤器中，把过滤器和循环卫生泵用硅胶管连接紧密，按过滤器和循环卫生泵的标准操作规程进行过滤，滤除硅藻土，得消化过滤液；c、超滤浓缩换缓冲液：用超滤系统浓缩过滤后的消化过滤液，用20mmol/LpH4.6醋酸缓冲液反复换液3次；d、离子交换层析：装柱：将阳离子交换介质用0.5mol/L NaOH溶液浸泡过夜，用去离子水漂洗至pH值≤8.0；将洁净的层析柱与蠕动泵相连接，将柱内充入大约1/5柱床体积的20mmol/L NaAc，pH4.6缓冲液，将上述处理的阳离子交换介质用同种缓冲液调成糊状后，沿柱的内壁注入柱内，待凝胶自然沉积约数厘米后，开动蠕动泵，调节流速在10ml/min左右，用50mmol/L，pH4.6 NaAc缓冲液平衡层析柱，至少3倍体积；离子交换层析柱清洗再生：用0.5mol/L NaOH溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≤8.0；再将层析柱用0.5mol/L HCl 溶液冲洗半小时以上，后用超纯水冲洗至pH值≥6.0；再将层析柱用50mmol/L NaAc，pH4.6缓冲液冲洗平衡，至少3倍柱体积；上样：用卫生泵将粗提胶原蛋白缓慢注入到层析柱中，用220mn紫外监测器监测，上样量以胶原蛋白5mg/ml离子交换介质计算；冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白：用20mmol/L NaAc，pH4.6缓冲液冲洗未吸附胶原蛋白和杂蛋白至少2倍柱体积，冲洗速度为30ml/min左右；洗脱吸附胶原蛋白：用含100mmol/L NaCl的20mmol/L，pH4.6 NaAc缓冲液洗脱，收集洗脱峰蛋白，即胶原溶液，洗脱速度为25ml/min左右，洗脱缓冲液约3柱倍体积；e、超滤浓缩换保存液：用超滤系统进行冲洗、清洗、膜堆的完整性检测、消毒除热原；浓缩离子交换洗脱的收集液溶液并用10mmol/L盐酸溶液反复换液3次；f、过滤除菌：用除菌过滤系统清洗、安装滤膜后对滤器进行高温蒸汽灭菌，灭菌后冷却至室温；将除菌后溶液的容器密封，4℃冰柜保存，除菌过滤溶液即为最终产品的胶原蛋白原液。