一种rhG-CSF重组工程菌的发酵培养方法

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的发酵培养方法。通过种子的优化制备，发酵过程中通过在发酵液中添加乳糖、发酵期间乳糖的流加以及溶氧和补料控制，使得rhG-CSF蛋白的表达量占菌体总蛋白的50%以上，收集的菌体置于-20℃保存，或直接用于制备高纯度的rhG-CSF蛋白，采用本发明生产的rhG-CSF蛋白，经纯化后纯度可达99.6%以上，生物活性不低于5.0×10⁸IU/mg。

主权项

一种重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的发酵培养方法，其特征在于：第一步、重组人粒细胞集落刺激因子重组工程菌的培养方法为：①菌种的筛选：取菌种P^ET‑G‑CSF/BL₂₁DE₃PlysS，至100mg/L氨苄青霉素的LB平板划线活化，35℃培养过夜，从平板上挑取单菌落接种于8mL的含100mg/L氨苄青霉素的LB液体试管，35℃，180r/min培养至OD_600nm为1.5～1.8，加入IPTG至浓度为0.1mmol/L，诱导4小时后，离心收集菌体，SDS‑PAGE电泳分析，挑选表达效果较好的单菌落重新划线，35℃培养过夜，培养完毕后在4℃保存，其中P^ET‑G‑CSF/BL₂₁DE₃PlysS是根据G‑CSF的cDNA序列，设计使用了大肠杆菌偏爱密码子，然后经过全基因合成，测序正确后构建了表达质粒pET‑G‑CSF，转化宿主菌BL21（DE3）PlysS，经过培养后酶切鉴定、表达筛选后获得表达G‑CSF的阳性克隆，保存菌种并标记为P^ET‑G‑CSF/BL₂₁DE₃PlysS；②一级种子液培养：从重新划线培养的平板挑取单菌落接种于装有8mL种子培养基并添加100mg/L氨苄青霉素液体试管，30～35℃，180r/min培养至OD_600nm为0.7～0.8，作为一级种子液；③二级种子液培养：将一级种子液以1%的体积比接种到含250mL种子培养基的500mL三角瓶中，30~35℃，130r/min培养至OD_600nm至1.5～1.8之间，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为rhG‑CSF发酵用种子；第二步、rhG‑CSF发酵用种子的发酵培养方法为：①发酵前的准备：将20L的发酵培养基加入30L发酵罐中，115℃灭菌20分钟；②发酵：灭菌后，待发酵培养基的温度降至35℃，将rhG‑CSF发酵用种子按接种量5%的体积比接入发酵罐，30～35℃，200r/min培养，随着菌体生长不断增加搅拌转速至500r/min，溶氧始终维持在35‑45%以上，氨水调pH为6.85～6.95，培养4小时；③诱导发酵：发酵培养4小时后加入IPTG至终浓度0.1～0.2mmol/L；④诱导后培养：IPTG诱导之后培养时间为4小时，培养温度为30～35℃，加入IPTG后，流加补料培养基，流加速度为0.75～1.25mL/L·min，溶氧维持在55%～70%之间，pH为6.85～6.95；所述的种子培养基配方为：蛋白胨 5g/L、酵母膏5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸氢二钾3g/L；所述的发酵培养基配方为：蛋白胨 5g/L、酵母膏 7.5 g/L、葡萄糖 5g/L、乳糖4g/L、磷酸二氢钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.75g/L、氯化铵1g/L；所述的补料培养基的配方为：蛋白胨60g/L、酵母浸出粉80g/L、葡萄糖200g/L、乳糖60g/L、硫酸镁20g/L；所述的补料培养基的流加速度以接种时间计为：4～4.5小时，0.75mL/L·min；4.5～5小时，0.9mL/L·min；5～6小时，1.0mL/L·min；6～7小时，1.1mL/L·min；7小时后，维持1.25mL/L·min直至培养结束；所述的30L发酵罐的转速调节方法如下：0～1.5小时，200r/min；1.5～2小时，300r/min；2～2.5小时，350r/min；2.5～3.25小时，400r/min；3.25～4小时，500r/min；4小时后维持500r/min。