主权项 |
一种检测溶藻弧菌、副溶血性弧菌及创伤弧菌多重降落PCR检测方法,其特征在于,由以下步骤制备而成: 取待检样本于0.5ml碱性蛋白胨水中37℃培养6h,取液体300µl ,4000rmp离心,留取沉淀加入50µl无菌水,震荡15秒钟,置100℃沸水中煮沸10min,冰上放置3~5分钟,1,3000转离心5分钟,取上清液约30µl即为DNA提取液;取下列浓度及体积的组分混合成25µl的反应体系:缓冲液 10×PCR 2.5 µl;<i>VA toxR</i>‑F 10 µmol/L 0.2 µl;<i>VAtoxR</i>‑R 10 µmol/L 0.2 µl;<i>VP col</i> –F 10 µmol/L 0.4 µl;<i>VPcol</i> –R 10 µmol/L 0.4 µl;<i>VVvvhA</i>‑F 10 µmol/L 0.4 µl;<i>VVvvhA</i>‑R 10 µmol/L 0.4 µl;<i>16S</i> –F 10 µmol/L 0.4 µl;<i>16S</i> –R 10 µmol/L 0.4 µl;MgCl<sub>2</sub> 25 mM 1.5 µl;dNTP 10 mM 2 µl;Taq DNA聚合酶 5 U/µl 0.2 µl;DNA 模板 1 µl;ddH2O 15µl;进行 PCR循环反应,循环参数如下:94 ℃ 8 min;94 ℃ 40s, 65 ℃ :每循环降低0.5℃,25 s, 72 ℃ 1 min,20个循环;94 ℃ 40s, 55 ℃ 25s,72 ℃ 1 min,20 个循环;72 ℃ 8 min;电泳检测鉴定:对PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测,如电泳图中含有740 bp、598 bp、349 bp和246 bp条带,其中740 bp、349 bp和246 bp分别代表检出创伤弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌,598 bp则代表提取出有效的模板;所述 <i>VAtoxR</i>‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;<i>所述VA toxR</i>‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述 <i>VPcol</i>‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述 <i>VP col</i>‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述 <i>VV vvhA</i>‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;所述<i>VV vvhA</i>‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述<i>16S</i>内参‑ F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;所述<i>16S</i>内参‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。 |