一种快速鉴别N6、N8亚流感病毒的方法

摘要

本发明提供了一种快速鉴别N6、N8亚型流感病毒的方法，本发明采用了一步法荧光定量RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one-step buffer，将多种酶配比进行混合，使实验操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染。本发明可定量几十个拷贝数，甚至几个拷贝，该方法操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N6和N8鉴别检测荧光定量RT-PCR试剂盒，用于N6和N8亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

主权项

一种快速鉴别N6、N8亚流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：取以下浓度及体积的反应试剂放入反应管中混匀：2X one‑step RT‑PCR Buffer                                     12.5μL；三种混合酶                       RNase inhibitor                                               5UM‑MLV                                                        40UTaq HS                                                          3U；          N6‑fwd         20μM                                      0.5μL ；N6rev           20μM                                      0.5μL ；                                    N8‑fwd          20μM                                      0.5μL ；N8‑rev          20μM                                       0.5μL ；N6 probe         10μM                                         0.5μL ；N8 probe         10μM                                         0.5μL ；N6 RNA模板                                                   10ng‑1μg；N8 RNA模板                                                   10ng‑1μg；RNase‑free ddH₂O                                            补至25μL；启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中；RT‑PCR反应条件：第一步20 min 42℃，第二步94℃ 1 min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存；60℃采集荧光，检测扩增曲线；所述N6‑fwd的碱基序列如SEQ IN NO:1所示；所述N6‑rev的碱基序列如SEQ IN NO:2所示；所述N8‑fwd的碱基序列如SEQ IN NO:3所示；所述N8‑rev的碱基序列如SEQ IN NO:4所示；所述N6 probe的碱基序列如SEQ IN NO:5所示；所述N8 probe的碱基序列如SEQ IN NO:6所示；N6探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；N8探针5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB；所述N6或N8 RNA模板的制备方法如下：取含N6或N8亚型的流感病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA：在1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体； 加入0.2 mL 的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2‑3min，然后离心 12,000× g，15 min，4°C；离心后管内分成三层，下面的红色为酚‑氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相； RNA沉淀  小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中， 加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10 min，离心12,000 × g，15min，4°C；离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀； RNA洗涤  去上清，向沉淀中加入1mL 75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000 × g，5min， 4°C； RNA溶解去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μL DEPC水充分溶解RNA。