一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法

摘要

本发明公开了一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌及其构建方法，属于生物工程技术领域，是将来源于米曲霉JN-412（CGMCC No.8474）的编码成熟脯氨酸氨肽酶基因导入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。上述基因工程菌能高效表达脯氨酸氨肽酶，发酵液上清中的酶活为25.87U/mL，比酶活为40.87U/mg，为后期研究脯氨酸氨肽酶的特性、结构等提供所需蛋白。

主权项

一种生产脯氨酸氨肽酶的基因工程菌，是将来源于保藏编号为CGMCC No.8474的米曲霉JN‑412的编码成熟脯氨酸氨肽酶基因导入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌；所述工程菌的构建步骤如下：1)从保藏编号为CGMCC No.8474的米曲霉JN‑412菌丝体中提取总RNA，并按照反转录试剂盒推荐条件合成双链cDNA；2)根据脯氨酸氨肽酶基因的特异性，设计引物从双链cDNA中克隆出脯氨酸氨肽酶基因，将所述脯氨酸氨肽酶基因转化E.coli DH5α，得到重组质粒pMD19‑pap；3)将步骤2)获得的脯氨酸氨肽酶基因克隆到载体pET‑28a(+)，转化E.coli BL21(DE3)，获得基因工程菌；所述工程菌的构建方法具体步骤如下：1)根据脯氨酸氨肽酶基因的特异性，设计上游引物P1：5'CGGGATCCATGGCTGCCAAACTAGTAGAC3'；下游引物P2：5'ATAAGAATGCGGCCGCCTAATCAATAGAGTCG 3'，以双链cDNA为模板，克隆目的基因；PCR体系为：10μM引物P1和P2各2μL，模板2μL，PrimeSTAR Max DNA聚合酶25μL，双蒸水补齐50μL；PCR条件：98℃预变性5min；98℃变性10s，59℃退火5s，72℃延伸90s，38个循环；72℃后延伸10min；目的基因PCR产物胶回收，末端加“A”，反应体系为：胶回收DNA片段25μL，10×PCR buffer 5μL，dNTPs 4μL，双蒸水补足50μL；反应条件为：72℃，30min；将加“A”后的DNA片段与T Vector pMD19‑T混合，于16℃过夜连接，转化E.coli DH5α，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑取20个转化子，提取重组质粒并进行质粒PCR和双酶切验证后送上海生工测序，重组质粒即pMD19‑pap；2)将重组质粒pMD19‑pap和空载pET‑28a(+)分别进行双酶切并切胶回收，胶回收产物于16℃过夜连接，转化E.coli DH5α，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取转化子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证后测序，重组质粒即pET‑28a(+)‑pap；将阳性克隆转化E.coli BL21(DE3)，在含卡那霉素抗性的LB平板挑取单菌落做表达验证。