5’端不受碱基限制的gRNA的制备方法

摘要

本发明公开了一种5’端不受碱基限制的gRNA的制备方法，包括如下步骤：提供Csy4蛋白；将所述Csy4蛋白特异性识别的识别序列插入到gRNA对应的DNA序列的N20位点之前得到第一序列，在启动子后插入用于提高转录效率的增益序列得到第二序列，通过搭桥PCR的方法将所述第一序列与所述第二序列连接得到pre-gRNA转录模板，接着利用转录试剂盒进行体外转录得到pre-gRNA；以及将所述Csy4蛋白与所述pre-gRNA加入到反应液中，充分反应后提纯，提纯得到的gRNA即为所需的gRNA。这种gRNA的制备方法可以快速的、高效的在体外制备gRNA，经过试验验证，制得的gRNA的5’端不受碱基限制，并且该gRNA在整体动物模型上有效。

主权项

一种5’端不受碱基限制的gRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提供Csy4蛋白；将所述Csy4蛋白特异性识别的识别序列插入到gRNA对应的DNA序列的N20位点之前得到第一序列，在启动子后插入用于提高转录效率的增益序列得到第二序列，通过搭桥PCR的方法将所述第一序列与所述第二序列连接得到pre‑gRNA转录模板，接着利用转录试剂盒进行体外转录得到pre‑gRNA；以及将所述Csy4蛋白与所述pre‑gRNA加入到反应液中，充分反应后提纯，提纯得到的gRNA即为所需的gRNA。