一种快速鉴别检测N1、N2、N6、N8亚型流感病毒的方法

摘要

本发明提供了一种检测鉴别N1、N2、N6和N8亚型流感病毒的方法，具体采用了一步荧光定量RT-PCR检测方法，将Buffer、dNTP、Enhance solution预混成2X one-step buffer，将多种酶配比进行混合，使实验操作的反应液配制更为简单方便，缩短操作时间，同时避免了操作污染，可定量几十个拷贝数，甚至几个拷贝，该方法操作简便、敏感性好、方便快捷，适合开发检测用的N1、N2、N6和N8鉴别检测荧光定量RT-PCR试剂盒，用于N1、N2、N6和N8亚型的临床鉴别诊断和流行病学调查，对我国流感的防控具有重要意义。

主权项

一种快速鉴别检测N1、N2、N6、N8亚型流感病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：取以下浓度及体积的试剂置于反应管中混匀：2X one‑step RT‑PCR Buffer                                     12.5μL；混合酶                      RNase inhibitor 5U、M‑MLV 40U 和Taq HS 3U  ；N1‑fwd  20μM                                           0.25μL；N1‑rev  20μM                                           0.25μL；N2‑fwd  20μM                                           0.25μL；N2‑rev  20μM                                           0.25μL；N6‑fwd  20μM                                           0.25μL；N6‑rev  20μM                                           0.25μL；N8‑fwd  20μM                                           0.25μL；N8‑rev  20μM                                           0.25μL；N1probe    10μM                                             0.25μL；N2 probe     10μM                                            0.25μL；N6 probe     10μM                                            0.25μL；N8probe      10μM                                            0.25μL；N1RNA模板                                                 10ng‑1μg；N2RNA模板                                                 10ng‑1μg；N6RNA模板                                                 10ng‑1μg；N8RNA模板                                                 10ng‑1μg；RNase‑free ddH₂O                                           补至25μL；启动荧光PCR仪器，将反应管放入PCR仪器中， RT‑PCR反应条件：第一步20 min 42℃，第二步94℃ 1 min，第三步95℃ 15s，60℃ 30s，进行45个循环，4℃ 保存，注：60℃采集荧光，记录扩增曲线；所述N1‑fwd 的碱基序列如SEQ IN NO:1；N1‑rev  的碱基序列如SEQ IN NO:2；N1probe 的碱基序列如SEQ IN NO:3；N2‑fwd 的碱基序列如SEQ IN NO:4；N2‑rev 的碱基序列如SEQ IN NO:5；N2 probe 的碱基序列如SEQ IN NO:6；N6‑fwd 的碱基序列如SEQ IN NO:7；N6‑rev  的碱基序列如SEQ IN NO:8；N6 probe 的碱基序列如SEQ IN NO:9；N8‑fwd  的碱基序列如SEQ IN NO:10；N8‑rev 的碱基序列如SEQ IN NO:11；N8probe  的碱基序列如SEQ IN NO:12；N1 probe 5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为BQ1；N2 probe 5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为BQ2；N6 probe 5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；N8 probe 5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB； 所述N1、N2、N6、N8 RNA模板的制备方法如下：分别取含取N1、N2、N6、N8亚型的流感病毒，按照Trizol试剂说明提取病毒RNA：在1.5mL的无RNA酶的EP管中加入200μL尿囊液和1mL的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体；加入0.2 mL 的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2‑3min，然后离心 12,000× g，15 min，4°C；离心后管内分成三层，下面的红色为酚‑氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相； RNA沉淀  小心将上层水相转移到另一无RNA酶的EP管中， 加入等量体积的预冷异丙醇，室温静置10 min，离心12,000 × g，15min，4°C；离心后可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀； RNA洗涤  去上清，向沉淀中加入1mL 75%预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻混匀，离心12,000 × g，5min， 4°C；RNA溶解  去上清，超净台内风干RNA沉淀，加入20μL DEPC水充分溶解RNA。