一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

摘要

本发明公开了一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用。本发明通过设计一个特殊的颈环结构作为媒介体，触发恒温指数扩增反应（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR），并在聚合酶的链置换反应作用下形成靶序列循环，在短时间内扩增产生大量短链DNA片段，激活脱氧核酶（deoxyribozyme），切割荧光底物，形成靶序列循环，恒温指数放大反应，以及脱氧核酶催化反应三重循环放大过程的串联，建立更为高效、快速的恒温指数放大技术，并将其应用于microRNA的超灵敏荧光检测。

主权项

一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：（1）发夹探针：包括5’端颈部、环部与3’端颈部，环部与待检核酸序列互补，3’端颈部延伸至少2nt碱基作为恒温指数扩增模板区，恒温指数扩增模板区含有切口酶识别位点；（2）恒温指数扩增引物：包括5’端序列和3’端序列，3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补；（3）脱氧核酶：从5’至3’依次包括启动区与催化区；启动区为发夹结构，其环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同，3’端颈部至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；催化区为锤头状核酶，其3’端至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；（4）脱氧核酶底物：其5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团，中部含有1个核糖核苷酸，腺嘌呤核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶启动区的3’端颈部、催化区的3’端互补。