一种利用天然纤维素为唯一碳源进行同步糖化发酵的方法

摘要

本发明提出了一种利用玉米芯纤维素为唯一碳源进行同步糖化发酵的方法。步骤为：构建载体pHBM368-pgk；构建分泌表达载体pHBM368-P-SB、pHBM368-P-SC、pHBM368-P-SE；将表达载体进行转化，得到能利用纤维素同步糖化发酵的重组酿酒酵母INVSc-P-SB、INVSc-P-SC、INVSc-P-SE。上述重组酿酒酵母可直接利用天然纤维素进行同步糖化发酵生产乙醇。以玉米芯纤维素为唯一碳源，连续培养120个小时，乙醇含量达到2.35g/L～6.37g/L。上述重组酿酒酵母可单独或混合进行同步糖化发酵生产乙醇。本发明工艺简单，转化效率高，废物利用，节能环保，能方便地提供生物能源——乙醇。

主权项

一种利用玉米芯纤维素为唯一碳源进行同步糖化发酵的方法，其特征在于构建能利用纤维素的酿酒酵母INVSc‑P‑SB、INVSc‑P‑SC、INVScP‑SE重组菌株的具体步骤为：a）载体pHBM368‑pgk的构建以表达载体pHBM368为基础，构建带有组成型强启动子pgk1的表达载体pHBM368‑pgk；利用PCR技术分别扩增5’‑端和3’‑端引入Nde I酶切位点和Not I酶切位点的pgk1启动子序列；通过T4DNA Ligase将pgk1启动子序列与经限制性内切酶Nde I和Not I消化的pHBM368相连接得到pHBM368‑pgk；b）分泌型表达载体pHBM368‑P‑SB、pHBM368‑P‑SC、pHBM368‑P‑SE的构建按基因文库号分别合成β‑葡萄糖苷酶基因bg（GeneBank：AF163097）、纤维素外切葡聚糖酶基因cbh（GeneBank：AY861348）、纤维素内切葡聚糖酶基因eg（GeneBank：EU169241），在bg、cbh、eg的5’‑端和3’‑端分别引入SnaB I酶切位点和Xba I酶切位点。将从pPIC9K载体中PCR扩增出5’‑端和3’‑端分别带有Not I和SnaB I的信号肽SS序列，用T4DNA Ligase将SS分别与bg、cbh、eg相连得到SS‑bg、SS‑cbh、SS‑eg；再通过T4DNA Ligas利用Not I及Xba I酶切位点将SS‑bg、SS‑cbh、SS‑eg连接到经Not I和Xba I酶切的pHBM368‑pgk载体上，得到重组载体pHBM368‑P‑SB、pHBM368‑P‑SC、pHBM368‑P‑SE；c)酿酒酵母的转化用Hpa I将pHBM368‑P‑SB、pHBM368‑P‑SC、pHBM368‑P‑SE线性化，通过电转化到酿酒酵母INVSc1中；以2%羧甲基纤维素为碳源代替YPD培养基中葡萄糖成分的固体培养基进行功能筛选，筛选出能利用纤维素的酿酒酵母INVSc‑P‑SB、INVSc‑P‑SC、INVScP‑SE重组菌株。