一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法

摘要

本发明公开了一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，包括以下步骤：选取花育45号种子，接种于MSB5培养基上培养；取发根农杆菌A4菌株，经培养活化，达到对数生长期；采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根；选取虫瘿多的花生根，浸没入NaCLO溶液中，弄碎，制成混合液；将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目，用无菌水喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液；将根结线虫悬液均匀接至花生毛状根培养皿，培养获得大量虫卵和二龄幼虫。本发明方法解决了难以获得纯化的大量根结线虫的问题，繁殖率高。

主权项

一种采用花生发根培养北方根结线虫的方法，其特征在于包括以下步骤：a花生毛状根的制备a1选取粒大饱满的花育45号种子，经消毒处理，然后用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于培养基上培养；a2无菌条件下，用接种环挑取低温冻存的发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固体平板上化线接种，然后置于恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10ml LB液体培养基中，于摇床内暗培养复苏；取0.05ml该菌液于10ml LB液体培养基中再次活化，使其达到对数生长期；a3当农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时采用发根农杆菌A4侵染步骤a1无菌培养6d的花育45号花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养毛状根；b北方根结线虫悬液及卵悬液的制备b1选取北方根结线虫病发病严重，虫瘿多的花生根，用剪刀剪成小段，浸没入NaCLO溶液中，将花生根段弄碎，并搅拌，制成混合液；b2将混合液倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目，用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物，使线虫和卵从根组织内移到表面，喷淋后期使用无菌水；喷淋后，取出325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得根结线虫悬液；取出500目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中一侧，然后再用少量无菌水从筛背面冲洗筛上物，收集液体到容器获得卵悬液；c北方根结线虫的接种与培养无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液或卵悬液，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置，用膜封口，培养获得大量虫卵和二龄幼虫。