利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用

摘要

本发明公开了一种利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用，采用从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分别扩增出的mTERT启动子、mTyr启动子和HN基因，将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-hrGFP-2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒Ad-mTERTp-Tyrp-HN；将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得高滴度的重组腺病毒；评价HN基因在双启动子的联合调控作用下对B16细胞的抑瘤效果。

主权项

一种利用mTERT启动子和mTyr启动子调控HN基因构建重组腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒(NDV)LaSota株感染的鸡胚尿囊液中分别扩增出mTERT启动子基因序列GI:AF157502.1、mTyr启动子基因序列GI:D00439.1和HN基因序列GI:EF211815.1；所述的mTERT启动子基因、mTyr启动子基因和HN基因的扩增包括：以mTERTp‑F SEQ ID NO：1和mTERTp‑R SEQ ID NO：2为引物，以C57BL/6小鼠的胸腺DNA为模版，扩增mTERT启动子；以Tyrp‑F SEQ ID NO：3和Tyrp‑R SEQ ID NO：4为引物，以小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA为模版，扩增mTyr启动子；以HN‑F SEQ ID NO：5和HN‑R SEQ ID NO：6为引物，以新城疫病毒NDV LaSota株感染的鸡胚尿囊液为模版，扩增HN基因；2)将获得的目的基因克隆到pShuttle‑IRES‑hrGFP‑2穿梭载体中，线性化重组穿梭载体后与骨架载体pAdeasy‑1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd‑mTERTp‑Tyrp‑HN；3)将重组腺病毒质粒由PacⅠ酶切后，经脂质体介导转染HEK293细胞，包装获得重组腺病毒Ad‑mTERTp‑Tyrp‑HN。