基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法包括如下步骤：（1）提取食源致病菌的RNA；（2）设计扩增引物；（3）进行NASBA反应；（4）设计捕捉探针；（5）制备纳米金探针；（6）制备胶体金核酸试纸条；（7）样品的检测。使用该方法检测单增李斯特菌的试剂盒包括引物（如SEQ ID NO.1和2所示）、酶、缓冲液、RNaseH、RNA酶抑制剂、dNTPs、NTPs、探针（如SEQ ID NO.4、5和6所示）和胶体金核酸试剂条等。本方法将NASBA与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，成本低，检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用安全。

主权项

一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)模板的准备：提取食源致病菌的RNA；(2)设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物：T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶识别的T7启动子序列；(3)NASBA反应：将步骤(1)制备的模板、步骤(2)设计合成的引物进行NASBA扩增反应，得到单链RNA产物；(4)探针的设计：根据单链RNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针1和探针2分别和单链RNA产物的两端互补，探针3与探针1完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团；(5)纳米金探针的制备：将步骤(4)中所设计合成的探针1与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针；(6)胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条；所述的金垫包埋有步骤(5)制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线；(7)检测：将由步骤(3)得到的RNA产物与含甲酰胺的柠檬酸钠缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测食源致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌；步骤(1)中所述的食源致病菌为单增李斯特菌；步骤(2)中所述的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA；步骤(2)中所述的食源致病菌保守序列为单增李斯特菌的16S rRNA基因的可变区序列；扩增保守序列的引物为：T7引物：5’‑AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAGCGATAGCC‑3’；引物2：5’‑AGCTTGCTCTTCCAA‑3’；探针1为：5’‑巯基‑GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG‑3’；探针2为：5’‑TTTCGGCTATCGCTTACAGATG‑生物素‑3’；探针3为：5’‑生物素‑CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC‑3’；所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法用于非诊断目的。