无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法

摘要

本发明提供了一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，对样品基因组酶切和加A，获得5’末端具有磷酸化修饰和3’粘性末端A的DNA片段，将其与含有不同条形码序列的甲基化接头相连；连接产物分为两组，一组进行PCR扩增，另一组经重亚硫酸盐转化后再扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；两组PCR产物分别混合，选择相同的特定长度片段序列进行低循环PCR，扩增产物分别分离纯化构建高通量简化甲基化测序文库。该方法通量高、成本低、序列一致，无需参考基因组，在大量无参考基因组或参考基因组组装不全物种的DNA甲基化表观遗传学研究领域应用前景广阔。

主权项

无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将lamda噬菌体基因组DNA加入待测样品的基因组DNA中；用限制性内切酶对待测样品的基因组DNA酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的DNA片段；(2)将步骤(1)获得的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；(3)纯化含有不同条形码的连接产物；将连接产物分为两份，一份作为对照组直接进行PCR扩增，另一份作为处理组经过重亚硫酸盐转化后再进行PCR扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；分别纯化两组PCR扩增产物，定量后混合每组的PCR扩增产物；将两组混合后的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，选择相同的特定长度片段序列切胶回收；(4)特定长度片段的两组产物分别低循环PCR扩增，对目的片段范围内的序列进行富集；两组低循环扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成简化甲基化测序文库。