免疫调控分子TIPE2在制备治疗血管增生性疾病的药物中的应用

摘要

本发明公开了免疫调控分子TIPE2在制备治疗血管增生性疾病的药物中的应用。本发明还公开了一种表达TIPE2的重组腺病毒。本发明利用TIPE2的重组腺病毒实现体内持续高表达TIPE2蛋白，发挥抑制血管平滑肌细胞的过度增殖的功能，通过抑制血管损伤引起的新内膜增生从而改善血管支架置入等术后并发症及预后，为临床上有效防治急性冠脉综合症血管内支架置入术后再狭窄及干预其它以血管平滑肌增生为细胞学基础的血管增生性疾病开辟了一条前景非常广阔的新途径，为新型药物的开发提供了依据。

主权项

一种表达TIPE2的重组腺病毒，其特征在于：是通过以下制备方法得到的：根据Gene ID:69769提供的基因序列设计引物，引物序列如序列表中序列3、4所示，PCR扩增TIPE2全长cDNA，两端设计BamH I和Xho I酶切位点，回收载体和目的片段，酶连获得pRK5‑TIPE2质粒，测序证实连接正确；BamH I and Xho I双酶切pRK5‑TIPE2质粒及pShuttle‑GFP‑CMV穿梭质粒，回收TIPE2目的片段及穿梭载体，酶连获得pShuttle‑GFP‑CMV‑TIPE2质粒；之后用限制性内切酶I‑Ceu Ⅰ和I‑Sce Ⅰ双酶切pADxsi骨架质粒与pShuttle‑GFP‑CMV‑TIPE2质粒，并将目的片段与pADxsi酶连，产物转化DH5α进行细菌内同源重组，筛选后的阳性克隆大量扩增获得pADxsi‑GFP‑CMV‑TIPE2重组腺病毒质粒；Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒后，用Lipofectamine 2000脂质体转染覆盖率80％的包装细胞HEK 293细胞，3‑5d后，出现明显噬斑；待90％的细胞出现细胞病变时，收集细胞上清，反复冻融3次以后离心收集上清，继续感染HEK 293细胞，扩增病毒，收集病毒液纯化后于液氮保存；所述BamH I and Xho I双酶切pRK5‑TIPE2质粒的构建，步骤为：(1)TIPE2基因CDS区获取：根据引物设计原则，设计TIPE2基因CDS区扩增引物，并分别在引物上下游分别加上BamH1及Xho1的酶切位点，在上游引物酶切位点与起始密码子ATG之间添加利于转录的Kozak’s序列；(2)TIPE2基因CDS区序列扩增：用2×Taq PCR Mix产品,以逆转录自C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞总RNA的cDNA为模板，采用PCR扩增法获取TIPE2基因CDS区片段，反应体系为50μL；(3)基因重组：双酶切目标片段、pRK5载体：利用BamH 1及Xho 1分别双酶切目标片段及pRK5载体，37℃酶切3h，以上酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并以胶回收试剂盒回收线性化片段；目的片段与载体连接，室温连接1h后，继续4℃过夜，然后70℃水浴灭活连接酶，终止反应；连接产物转化：以大肠杆菌DH5α为宿主菌，利用CaCl₂法将上述连接产物转化入处于感受态的宿主菌，涂菌于LA平板于37℃恒温培养箱培养16h。