大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌的易错全基因组改组方法及耐受丁醇的大肠杆菌，耐受丁醇的大肠杆菌其分类命名为大肠杆菌Bw1.8-4(Escherichia coli)Bw1.8-4，保藏号CCTCC NO：M2015365。本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌,能在0.85％V/V丁醇的LB液体培养基中高效的生长。本发明运用易错PCR技术实现无需理化诱变和原生质体融合即能快速有效获得耐受丁醇的大肠杆菌，避免了传统理化诱变菌带来的化学试剂和辐射的污染，也避免了连续驯化周期长的缺点,与传统的全基因组改组技术相比，本发明的方法获得的耐受丁醇的大肠杆菌比出发菌株耐受丁醇能力强。

主权项

大肠杆菌的易错全基因组改组方法，其特征是包括如下步骤：(1)基因组DNA提取：提取出发菌株大肠杆菌BW25113的基因组DNA；(2)易错PCR扩增全基因组：取5μL的dNTPS母液、16.6μL的100uM10‑17个碱基的随机引物、3μL的15mM的MnCl₂、5μL的10×突变buffer、20ng步骤(1)获得的基因组DNA、2.5μL的2U/μL Taq DNA聚合酶、补充无菌水至50μL；所述dNTPS母液含10mM dCTP和dTTP、2mM dATP和dGTP；所述10×突变buffer含1mM pH8.3的Tris‑HCl，0.7mM MgCl₂、5mM KCl、1g/100mL甘油；易错PCR反应条件：94℃预变性5分钟；92℃1min，再在37℃的条件下退火1min，再由37℃以每秒变化0.1℃的速度升至55℃，55℃延伸4min，进行50个循环，55℃补充延伸10min；(3)全基因组改组：将步骤(2)获得的PCR产物通过乙醇沉淀浓缩10倍，制备出发菌株大肠杆菌BW25113的感受态细胞；取浓缩后的PCR产物3‑5μL至50ul所述大肠菌的感受态细胞，1800V电击后加入LB液体培养基，混匀后转移到无菌离心管中于37℃静置培养1‑2小时，涂布于丁醇浓度为1‑1.6％V/V的LB固体培养基筛选平板，倒置放于培养箱37℃培养1‑3天，得单克隆即转化子；(4)评价：挑取步骤(3)所述单克隆至LB液体培养基中于静置培养至对数晚期,保存菌液；分别接种上述单克隆的菌液和出发菌株大肠杆菌至LB液体培养基，培养至OD₆₀₀为1.2‑1.8；再分别转接至丁醇浓度为0.8％V/V的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇的转化子；(5)第二轮全基因组改组，即转化子Bw1.3(2)‐4的改组：将步骤(4)中获得的丁醇耐受性最强的转化子Bw1.3(2)‐4进行第二轮的易错全基因改组；为提高外源易错PCR产物与基因组中的各个基因的重组效率，将含有Red重组酶基因的pKD46质粒从大肠杆菌BW25113菌中提取后重新转化到转化子Bw1.3(2)‐4，获得含有pKD46质粒的Bw1.3(2)‐4的菌株，按照步骤(1)‐(3)对含有pKD46质粒的Bw1.3(2)‐4的菌株进行全基因组改组，其中步骤(3)所述LB固体培养基筛选平板的丁醇浓度改为1.6‐2.0％V/V，筛选得到单克隆即转化子；(6)第二轮全基因改组后获得转化子的丁醇耐受评价：挑取步骤(5)所述单克隆、大肠杆菌BW25113、转化子Bw1.3(2)‐4分别接种至LB液体培养基，培养至对数晚期，再分别转接至丁醇浓度为0.85％V/V的含丁醇的LB液体培养基，使各个菌株的初始接种浓度一致，测定生长曲线，筛选出耐丁醇能力更强的转化子。