人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用

摘要

本发明公开了人源基质细胞衍生因子1α的表达载体、构建方法及应用。所公开的人源基质细胞衍生因子1α的表达载体是将hSDF-1α基因插入到质粒pET15b中构成的重组质粒pET15b-hSDF-1α；同时公开了该人源基质细胞衍生因子1α的表达载体的构建方法，并公开了将所构建的表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中对人源基质细胞衍生因子1α进行表达。

主权项

人源基质细胞衍生因子1α的诱导表达，其特征在于，包括：(一)利用人源基质细胞衍生因子1α的表达载体和大肠杆菌BL21(DE3)构建重组菌BL21(DE3)/pET15b‑hSDF‑1α；所述人源基质细胞衍生因子1α的表达载体是将人源基质细胞衍生因子1α基因插入到质粒pET15b中构成的重组质粒pET15b‑hSDF‑1α，所述重组质粒pET‑15b‑hSDF‑1α构建方法包括：(1)引物设计：根据美国国立生物技术信息中心提供的hSDF‑1α cDNA序列设计引物，去掉信号肽仅克隆成熟肽序列213bp，并在两端插入Nco Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点及保护碱基，设计合成引物序列为：上游引物为：5ˊGATGCCATGGACGGGAAGCCCGTCAGC 3ˊ；下游引物为：5ˊCGCGGATCCTTACTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGT 3ˊ；(2)hSDF‑1α基因的PCR扩增：PCR的模板为带hSDF‑1αcDNA片段的重组质粒pCMV‑SPORT6‑SDF1α，模板浓度为0.2324ng/μL；上游引物、下游引物的浓度均为10μmol/L；50μL的PCR的反应体系中含有：25μL Premix、1μL模板质粒、1μL上游引物、1μL下游引物、其余为无菌水；PCR的反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；胶回收PCR产物；(3)双酶切PCR产物：40μL的PCR产物酶切体系中含有：1μL Nco Ⅰ、1μL BamH Ⅰ、4μL 10×K Buffer、4μL 0.1％BSA、30μL PCR产物、其余为无菌水；37℃酶切处理；胶回收双酶切的PCR产物；(4)双酶切质粒pET15b：20μL的质粒pET15b酶切体系中含有：1μL Nco Ⅰ、1μL BamH Ⅰ、2μL 10×K Buffer、2μL 0.1％BSA、10μL pET15b质粒、其余为无菌水；37℃酶切处理；胶回收双酶切的质粒pET15b产物；(5)目的片段与载体质粒pET15b的连接：双酶切PCR产物和双酶切质粒pET15b产物进行连接反应：10μL反应体系中含有1μL10×T₄DNA Ligase Buffer、6μL双酶切的PCR产物、2μL双酶切的质粒pET15b产物、0.5μL T₄DNA Ligase、其余为无菌水；16℃反应12‑24小时，得pET‑15b‑hSDF‑1α；(二)对重组菌BL21(DE3)/pET15b‑hSDF‑1α进行诱导处理，对hSDF‑1α诱导表达：将重组菌BL21(DE3)/pET15b‑hSDF‑1α接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养；次日，按体积比为1％的接种量接种菌液至含有Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.4‑0.6，加入诱导剂IPTG，使IPTG的最终浓度为1.0mmol/L，30℃下诱导处理后，离心收集菌体，hSDF‑1α在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式存在；(三)冰浴条件下超声破碎诱导处理后的重组菌BL21(DE3)/pET15b‑hSDF‑1α，之后离心收集沉淀物，超声破碎时所用的超声破碎裂解液由10mmol/L Tris‑HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0，每克重组菌BL21(DE3)/pET15b‑hSDF‑1α使用10mL超声破碎裂解液；(四)沉淀物先用洗涤液A重悬，之后收集沉淀；接着再用洗涤液B重悬沉淀物，收集沉淀为包涵体；其中洗涤液A由体积比为1％的Triton‑X100、10mmol/L Tris‑HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；洗涤液B由0.5mol/L盐酸胍、10mmol/L Tris‑HCL，5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；(五)利用变性液重悬包涵体，20‑30℃静置40‑60min，之后离心收集上清液；其中所述变性液是由浓度为6mol/L盐酸胍、体积比为7/105的β‑巯基乙醇、10mmol/L Tris‑HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；每克包涵体使用5mL变性液；(六)上清液中加入复性液得复性样品，所述复性液是由1mmol/L还原型谷胱甘肽、0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽、10mmol/L Tris‑HCL、5mmol/L EDTA组成，且pH为8.0；每体积上清液使用20体积复性液；复性液以滴加方式加入上清液中，且在12‑48小时滴加完；(七)将复性样品离心收集得上清液样品，用阳离子交换柱SP Sepharose F.F.1mL预装柱对上清液样品进行纯化得到目标蛋白；分离纯化时所用平衡液A液的组分有20mmol/L Tris‑HCL、0.3～0.4mol/L NaCl，pH为8.5，且用0.45μm水性膜过滤；洗脱液B液：在平衡液A液中加入1mol/L NaCl，且用0.45μm水性膜过滤；洗脱条件：梯度0％洗脱液B液～100％洗脱液B液、洗脱体积20ml、洗脱流速1.0ml/min、紫外检测波长280nm；(八)利用Sepherdex G‑25柱对目标蛋白进行脱盐，收集280nm色谱峰对应的分离物；脱盐时所用缓冲液为：10mmol/L PB，pH 7.0。