一种产超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种产R,R-2,3-丁二醇基因工程菌及其构建方法与应用，该基因工程菌株的命名为重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044--dar^-。dar为丁二酮还原酶基因，通过同源重组双交换，敲除多粘类芽孢杆菌CGMCC3044中的dar基因获得菌株重组多粘类芽孢杆菌CGMCC3044-dar^-。通过上述方法构建的重组菌能发酵合成超高光学纯度R,R-2,3-丁二醇，光学纯度高达100%，无光学副产物meso-2,3-丁二醇，该菌株能直接利用菊芋菊粉、葡萄糖、3-羟基丁酮等底物，培养条件粗放，操作方便简单，光学纯度高，生产成本低，有利于大规模产业化生产。

主权项

高光学纯度R,R‑2,3‑丁二醇基因工程菌，该工程菌是通过下列方法构建得到：利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044中扩增出丁二酮还原酶基因 dar，5’端39bp碱基序列构成同源臂Ⅰ，3’端20 bp碱基序列构成同源臂Ⅱ，通过多克隆位点将同源臂Ⅰ和同源臂Ⅱ分别串联到携带λ Red同源重组序列克隆粘粒SuperCos‑1/ pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R序列的两端，得到含dar同源臂Ⅰ‑oriT‑ Apra^R ‑dar同源臂Ⅱ序列的重组粘粒SuperCos‑1/ pIJ790‑dar同源臂Ⅰ‑oriT‑ Apra^R ‑ dar同源臂Ⅱ，重组粘粒转化多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044，并在λ Red介导下与多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产超高光学纯度R,R‑2,3‑丁二醇基因工程菌CGMCC 3044‑ dar^‑，该工程菌通过下列方法构建得到：（1）基因dar的克隆：根据Genebank公布的多粘类芽孢杆菌ATCC 12321中dar基因的序列设计合成PCR所需的引物：P1：5’‑ATGGAACTTAAAAACAAAACAGCC‑3’P2：5’‑CTGTGGGTTGGTTGTCCAAAT‑3’以多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044基因组为模板完成PCR反应：PCR反应条件：94°C变性5 min，经94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共32个循环，再经过72℃延伸10 min，获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18‑T载体连接，进行序列测定，获得来源于多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044的丁二酮还原酶基因，即dar基因；（2）重组粘粒SuperCos‑1/ pIJ790‑ dar同源臂Ⅰ‑oriT‑ Apra^R ‑dar同源臂Ⅱ的构建；（3）重组基因工程菌的获得：将重组粘粒SuperCos‑1/ pIJ790‑dar同源臂Ⅰ‑oriT‑ Apra^R ‑dar同源臂Ⅱ转化多粘类芽孢杆菌CGMCC 3044，涂布含40 μg/mL 阿泊拉霉素平板，挑取阳性重组子，并进行菌落PCR鉴定，得到重组多粘类芽孢杆菌，命名为CGMCC 3044‑ dar^‑。