| 摘要 |
1. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для анализа генетического полиморфизма в локусах ДНК ApoE (rs429358, rs7412), ApoJ (rs11136000) и GAB2 (rs2373115), предусматривающего следующие стадии:(а) - амплификация полиморфных фрагментов генов ApoE, ApoJ и GAB2 с помощью мультиплексной «гнездной» двухэтапной ПЦР, в которых в качестве матрицы для амплификации используется образец ДНК; при проведении ПЦР используется набор праймеров с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 9-20; в результате чего, на втором этапе ПЦР образуется флуоресцентно меченый ПЦР-продукт;в мультиплексной реакции I этапа используют праймеры: 9, 10, 13, 14, 17, 18;в мультиплексной реакции II этапа используют праймеры: 11, 12, 15, 16, 19, 20;реакционная смесь на первом этапе ПЦР содержит 5 пкмоль каждого праймера, 67 мМ Трис_HCl, pH 8.6, 166 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из dNTP, 2.5 ед. акт. Taq-полимеразы и матрицу в количестве не менее 10 нг геномной ДНК. Реакция проводится в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94°C (5 мин), 35 циклов амплификации по следующей схеме: 94°C, 30 с; 65°C, 30 с; 72°C, 30 с; далее 72°C, 10 мин. Второй этап ПЦР проводят в реакционной смеси того же состава, но вместо 5 добавляют по 50 пкмоль одного из праймеров и с добавлением флуоресцентной метки для преимущественной наработки флуоресцентно меченого одноцепочечного ПЦР-продукта.(б) - иммобилизация олигонуклеотидных зондов, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1-8;(в) - гибридизация меченого ПЦР-продукта с иммобилизованными олигонуклеотидами, представленными в SEQ ID NO: 1-8;(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации.2. Набор олигонуклеотидов для идентификации полиморфных фрагментов генов, амплифицирован� |
