一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用，bPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以牛全血基因为模板，以SEQ IDNo3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得带有酶切位点的牛朊蛋白DNA序列，将其连接到pPROEX-htb质粒上，通过定点突变技术除去表达载体中目的基因之前的多余酶切位点，获得bPrP全真表达载体。将该载体在大肠杆菌中表达，过高亲和力层析柱纯化、复性，得到了和天然prion蛋白具有相同构象的重组朊蛋白。本发明所得到的牛朊蛋白氨基酸序列与天然牛朊蛋白高度相似（仅N端多了一个甘氨酸），可用于开发牛朊蛋白单克隆抗体、对牛的朊病毒病诊断试剂盒用。

主权项

一种制备重组牛朊蛋白bPrP的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将重组表达载体转化入感受态细胞，制得牛朊蛋白bPrP表达工程菌；其中所述重组表达载体为pPROEX‑htb‑bPrP，其含有重组牛朊蛋白bPrP编码基因的表达盒，其中重组牛朊蛋白bPrP氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，重组表达载体pPROEX‑htb‑bPrP通过如下步骤构建得到：①PCR方法扩增bPrPc基因，PCR方法所用的引物序列分别为：上游引物：cgcGGATCCCTCTGCAAGA AGCGACC，划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点,下游引物：cccAAGCTTATGCCCCTCGT TGGTAAT，划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点；②将PCR产物和载体pPROEX‑htb分别用内切酶BamHI和Hind III双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒；③以前期表达质粒为模板，以除去bPrPc基因前的酶切位点为目的设计引物，进行PCR反应，所述引物为：P1：GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGACCAAAACCTGGAGGP2：CCTCCAGGTTTTGGTCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC；将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX‑htb‑bPrP；2）将牛朊蛋白bPrP表达工程菌经IPTG诱导表达；将表达产物过镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的牛朊蛋白bPrP；所述的诱导表达是将牛朊蛋白工程菌接种至20mL含有氨苄青霉素50mg/mL的LB培养基中过夜培养，按1%的量接种2L含50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm培养至细菌生长对数期OD₆₀₀=0.4‑0.6；加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，37℃160rpm培养，诱导后6h收集菌液；取1mL表达菌体离心，在沉淀中加入30μL PBS悬浮后，再加入30μL加样缓冲液混匀，加样缓冲液的配方：SDS 0.5g，巯基乙醇1mL，甘油3mL，溴酚蓝4mg，1M pH6.8Tris‑HCl缓冲液2mL，加蒸馏水定容至10mL；裂解变性5min，8000rpm离心后，取10μL上清液上样，同时设蛋白标准分子量孔，进行12%SDS‑PAGE检测；3）将纯化的牛朊蛋白bPrP复性后加入rTEV内切酶，切除组氨酸标签，然后再次通过镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱除去组氨酸标签和重组rTEV酶，将洗脱收集的液体超滤浓缩，得到重组牛朊蛋白bPrP，其中加入rTEV蛋白酶，切除组氨酸标签的具体步骤为：按每1ml浓度为1mg/ml添加500U的rTEV蛋白酶，4℃过夜消化后，通过1ml的镍‑NTA琼脂糖树脂层析柱，使用前用10ml透析液C平衡，收集到的液体就是最终的牛朊蛋白bPrP；透析液C的配方为20mM Na₃PO₄、10%甘油pH7.4。