一种用于检测HHV-6A/6B型的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开一种用于检测HHV-6A/6B型的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及检测方法；试剂盒包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HHV-6A病毒基因阳性质控、HHV-6B病毒基因阳性质控、HHV-6A/6B病毒基因阴性质控和内标溶液；方法包括如下步骤：1）受检样品处理；2）质控品的处理；3）配制PCR反应混合液；4）生成微反应液滴，并进行数字PCR反应扩增；5）读取荧光信号，分析HHV型别并计算拷贝数。本发明采用数字PCR技术和双色荧光探针，同时检测HHV-6的两个亚型，具有精准绝对定量的特点；可满足早期、准确、分型定量诊断HHV-6感染的要求。

主权项

一种用于检测HHV‑6A/6B的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，其特征在于，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HHV‑6A病毒基因阳性质控、HHV‑6B病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；所述DNA提取液包括50 mM pH 8.3的Tris‑HCl、0.5 M NaCl、5 mM EDTA、质量浓度为1.5%的CTAB和2 mM的DTT；所述数字PCR反应缓冲液A包括HHV‑6A型的引物及探针和HHV‑6B型的引物及探针；所述数字PCR反应缓冲液B包括内标的引物及探针；所述HHV‑6A、HHV‑6B和内标的引物及探针如下所示：HHV‑6A型和HHV‑6B型通用上游引物：CCGTGGGATCGTCTAAAATTATAGATGT；HHV‑6A型和HHV‑6B型通用下游引物：CCACACTAGTCCGGACGGATAA；HHV‑6A型探针：CTGGAACTGTATAATAGG；HHV‑6B型探针：CTGGAGCTGTACAACAG；内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG；内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG；内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC；所述HHV‑6A型探针5’端荧光报告基因为FAM，HHV‑6B型探针5’端荧光报告基团为VIC，内标探针5’端荧光报告基团为VIC，所有探针 3’端淬灭基团均为BHQ；所述HHV‑6A病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HHV‑6A的标准质粒混合液；所述HHV‑6B病毒基因阳性质控为100 copies/μL的HHV‑6B的标准质粒混合液；所述阴性质控为灭菌生理盐水；所述内标溶液为100 copies/ul的β‑globin的标准质粒溶液。