一种用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗及制备方法

摘要

本发明提供了一种用于动物弓形虫病预防的重组卡介苗，本发明还提供了该疫苗的制备方法，利用重组卡介苗(rBCG)集佐剂和载体于一身，兼外源基因与活疫苗于一体，接种后可诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫，而且又能表达细胞因子和弓形虫抗原蛋白，表达的细胞因子能使表达的蛋白发更好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。本发明疫苗热稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产，产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。

主权项

一种穿梭表达载体用于犬弓形虫病预防的重组卡介苗疫的制备方法，包括以下步骤：分别参照犬白介素2（DIL‑2）基因DNA序列和刚地弓形虫保护性抗原Rhomboid基因DNA序列及穿梭载体pMV261物理图谱设计2对引物并引进酶切位点；犬白介素2（DIL‑2）上游引物IL‑F：5`‑ CCGGAATTCATGTACAAGATACAACTCTTGTCTT ‑3`，5`端含有EcoRI酶切位点；犬白介素2（DIL‑2）下游引物IL‑R：5`‑ CGCGGATCCTGTCATTGTTGAGTAGATGCTTT ‑3`，5`端含有BamHI酶切位点；Rhomboid基因上游引物ROM‑F:5`‑GGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG‑3`，5`端含有BamHI酶切位点；Rhomboid基因下游引物ROM‑R: 5`‑AAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG‑3，5`端含有HindIII酶切位点；将犬白介素2（DIL‑2）PCR纯化产物克隆至pMD18‑T载体并进行PCR、测序鉴定并命名pMD18‑T‑IL2，将刚地弓形虫保护性抗原Rhomboid基因PCR纯化产物克隆至pMD18‑T载体并进行PCR、测序鉴定并命名pMD18‑T‑Rho，将pMD18‑T‑IL2用EcoRI、BamHI酶切回收小片段，将pMD18‑T‑Rho用BamHI、HindIII酶切回收大片段回收小片段，对与EcoRI、HindIII进行酶切的穿梭表达载体pMV261连接 ，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRI、HindIII、BamHI、进行三酶切反应，重组质粒命名为pMV261‑IL2‑Rho；将BCG接种于MB7H9 ADC液体培养基中，37℃培养至对数生长期，离心收集菌体，沉淀用10%甘油洗涤，最后重悬1ml 10%甘油中，用于电转化；取60‑80ulBCG感受态菌液加入0.1ug重组质粒PMV261‑IL2‑Rho置于电转杯中；电穿参数：电压2.5KV,电容25μF，电阻1000Ω；电穿孔转化后立即加入MB7H9 OADC培养基中，37℃培养2d后涂布于含20ug/mlKan MB7H9 OADC培养基平板，3w后长出转化菌落；从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于液体培养基（含Kan）,37℃培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45℃水浴中诱导4h，离心收集菌体，并处理，最后加入等体积2×SDS‑PAGE上样缓冲液，100℃5min；取12ul上述菌液SDS‑PAGE分析及Western blotting 鉴定，即得。