快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法

摘要

本发明涉及一种快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，首先提取贝类的基因组DNA，4℃冰箱保存备用；然后利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性内切酶方法获得贝类基因组DNA片断，并构建富集文库；接着将富集文库中的含有插入片断的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆；最后阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA。本方法可靠性和重复性极好，并且阳性克隆率可以达到100％，一次筛选可以获得上百甚至几百个位点，可以在一周之内获得大量微卫星标记的有效的技术方法。

主权项

1.快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，其特征在于操作步骤：1)提取贝类的基因组DNA 4℃冰箱保存备用；2)富集文库的构建；3)菌落原位杂交；4)阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA；其中1)提取贝类的基因组DNA，步骤为：贝样活体解剖后取闭壳肌0.1克，加入500μl STE裂解缓冲液，所述缓冲液为NaCl：100mM；EDTA：1mM，pH＝8.0；Tris-HCl，10mM，pH＝8.0，剪碎，再加入50μl 10％SDS，以及5μl的20mg/ml的蛋白酶K，56℃处理，直到裂解液澄清；加入250μl饱和酚、250μl的24∶1的氯仿/异戊醇，抽提3次；取上清液，加入500μl氯仿/异戊醇抽提1次；取上清液，加入50μl 3M NaAc，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min；将核酸沉淀于管底；1000μl 70％乙醇洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发；加入100μl的无菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存；2)富集文库的构建步骤为：(1)贝类基因组DNA片断获得或采用①：在构建富集文库时，AFLP片断获得的方法为：EcoR I和Mse I各一个单位完全双酶切300ng基因组DNA，T4连接酶将酶切片段连上接头；PCR反应总体积为50μl，内含5μl连接产物，0.2mmol/L的引物，即E00，序列为：GACTGCGTACCAATTC；M00序列为：GATGAGTCCTGAGTAA，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，2.5U的Taq DNA聚合酶；PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；PCR反应结束后，10个PCR反应产物混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃变性5分钟待用；或采用②贝类基因组DNA片断获得，限制性酶切片断的获得的方法为：取300ng栉孔扇贝总DNA，在20μl体系中用2个单位的限制性内切酶HaeIII酶切3个小时；酶切后T4连接酶连上接头，连接反应为30μl，其中含有酶切产物20μl，接头组成为：21-mer：5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA和5’磷酸化的25-mer：5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA的接头50ng，1×T4连接缓冲液，T4连接酶2U，反应在16℃下反应12小时；连有接头的DNA经PCR扩增获得多个拷贝，PCR反应总体积为25μl，其中含有DNA片断的连接产物6μl，1mM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶；PCR反应为25个循环，每个循环包括：95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循环前预变性3min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；PCR结束后，10个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95度变性5分钟待用；(2)基因组片断的富集：①杂交膜的准备：取浓度为100mM的探针(GA)20和(CA)20各0.5μl点在直径为5mm的Hybond N+杂交膜上，空气中晾干后80℃烘烤2个小时固定探针；将固定好探针的Hybond N+膜放在杂交液中37℃预杂交72小时，其中杂交液为50％V/V的甲酰胺、7％W/V的SDS、5×SSC、50mM、pH＝7.0的磷酸钠；然后将膜在1％的SDS中沸浴10分钟，去除没有结合好的探针；②杂交：将变性好的基因组DNA片断加入到600μl的杂交液中，加入预杂交好的HybondN+膜，37℃杂交1-2天；③洗脱：洗膜采用如下严谨度：用600μl的2×SSC，1％W/V的SDS洗脱液在60℃下水浴下洗脱2次，每次15分钟；用600μl的2×SSC，1％W/V的SDS洗脱液在62℃下水浴30分钟；用500μl的0.5×SSC，1％W/V的SDS洗脱液在65℃下水浴30分钟洗脱杂交片断；再将500μl的洗脱液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的异丙醇，-20℃冷冻2个小时以上，4℃12,000转离心20分钟，将沉淀用-20℃预冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水；(3)富集产物的克隆：取洗脱片断溶液2μl作为恢复PCR的模板，反应为20个循环，最后72℃延伸30分钟；PCR反应结束后乙醇沉淀，三蒸水溶解，富集DNA片断的克隆采用Takara公司的pMD18-T载体试剂盒，将连接好的产物转化至大肠杆菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固体LB平板上；3)菌落原位杂交筛选阳性克隆的步骤如下：(1)菌落重排与转膜：将转化后的白斑重新挑起，有序的重排接种至新的固体LB培养基上，37℃培养；培养好菌落转至硝酸纤维素膜上，然后膜在空气中干燥10分钟；然后硝酸纤维素膜放入0.5M NaOH，1.5M NaCl变性缓冲液中变性7分钟，空气干燥10分钟；0.5M Tris-HCl，pH 7.2，1.5M NaCl，1mM EDTA，pH 8.0的中和缓冲液中和2次，每次5分钟；将中和好的硝酸纤维素膜空气干燥后放入80℃烘烤2小时固定；(2)探针的标记：探针的标记采用Amersham公司的Gene Images3’-Oligolabelling Module试剂盒；标记反应在37℃下标记70分钟，80μl反应体系中含有100μM的探针1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×缓冲液，32U的末端转移酶；标记好的探针放入-20℃冰箱中备用；(3)杂交：杂交系统采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Ki t试剂盒；将烘烤好的硝酸纤维素膜放入杂交液中预杂交1小时，该杂交液为5×SSC，0.1％W/V的SDS，稀释20倍的封阻液，0.5％W/V的分子量为500000的多聚硫酸葡聚糖；然后将杂交液去除，加入足量的杂交液和标记好的探针，使杂交液的量为0.125-0.25mL/cm2，探针的浓度为5-10ng/mL，37度振荡杂交过夜；(4)洗脱：将杂交过夜的硝酸纤维素膜放在5×SSC，0.5％SDS的洗脱液中室温振荡洗脱2次，每次5分钟；然后在含有1×SSC，0.5％SDS的洗脱液中37℃振荡洗脱15分钟，含有1×SSC，0.5％SDS的洗脱液中42℃振荡洗脱15分钟；(5)抗体-抗原反应于放射自显影：将膜放入到含有稀释20倍的液体封阻中封阻至少30分钟，然后将膜放入到抗体液中反应30分钟后，抗体液含有1000倍稀释的抗体，0.5％W/V的小牛血清，0.4M NaCl，0.1M、pH＝7.5Tirs-HCl，处理完NC膜后，在暗室中压上X光胶片，感光1小时进行显影及定影；(6)阳性克隆的确定以及阳性克隆的测序：按照原先确定的方位，将X-胶片、硝酸纤维素膜、平板三者进行对照，在相同的位置上挑出阳性克隆，用M13引物测序；4)根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA：在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断；引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计用以下严谨度：(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度45-65度；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。