重组人载脂蛋白Pro-ApoAIm的制备方法

摘要

本发明公开了一种构建人载脂蛋白AI_milano表达基因的制备方法。该方法采用PCR引物制成pro-ApoAIm的基因，构建表达基因PET12a/PAPOAIm重组质粒再进行工程菌的构建，然后构建的工程菌在一定的发酵条件下发酵，进行pApoAI_m的蛋白纯化，纯化的蛋白再制成pro-ApoAIm蛋白二聚体形式。本方法具有pro-ApoAIm比ApoAIm性质更稳定，在大肠杆菌表达体系中采用T7启动子表达载体pET12a，用IPTG诱导目的蛋白的生产，产生蛋白是包涵体，它能有效防止蛋白水解酶对异源蛋白的水解等特点。

主权项

1、一种获得高活性的人载脂蛋白pro-ApoAIm的制备方法，由下列步骤组成：a、设计pro-ApoAIm PCR引物核苷酸序列制成pro-ApoAIm基因，其中，PCR引物核苷酸序列为2H：5’GGATCCATGCGTCATTTCTGGCAACAAGACGAACCGCCGCAGAGCCCCTGGGATCGAGTAAAG3’(BamHI)A：5’GTCGACGCGCTGCGTACCCACCTGGCTCCTTACAGCGACGAGCTGCGTCAGTGCTTG3’(SalI)B：5’GTCGACGTGAGCACGCGCACGGTCACGCATCTCC 3’(SalI)6：5’AGATCTTTATCACTGGGTGTTGAGCTTCTTGGTG3’(BgIII)采用上述引物，从人pro-ApoAI基因cDNA片段中，通过PCR得人pro-ApoAIm基因，即通过DNA引物设计直接导致蛋白第173位氨基酸点突变制成pro-ApoAIm表达基因；b、将步骤a所得的pro-ApoAIm基因亚克隆到载体上DNA测序再克隆到表达载体PET12a上，构建得表达基因的重组质粒PET12a/pro-ApoAIm；c、将步骤b构建的重组质粒导入宿主细胞，构建得工程菌；d、将步骤c构建的工程菌发酵，获得目的蛋白pro-ApoAIm；e、对步骤d所得的pro-ApoAIm蛋白进行纯化；f、将步骤e纯化所得的蛋白进行pro-ApoAIm蛋白二聚体的制备。