共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法

摘要

本发明猪繁殖与综合症病毒和猪圆环病毒双价核酸疫苗的制备方法，简称共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法，本发明根据哺乳动物细胞真核表达载体pIRES MCSA MCSB多克隆位点的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD1株的ORF2基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基因起始密码子的前面加入Kozak序列，分别设计了针对ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1/H2。将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建成重组质粒pIRES-ORF2/ORF5。经PCR、RT-PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-ORF2/ORF5。

主权项

1.共表达PRRSV ORF5和PCV2 ORF2双价核酸疫苗的制备方法，其特征在于在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF5和PCV2ORF2完整基因，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV GP5蛋白和PCV2Cap蛋白；上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：1)ORF2及ORF5的扩增扩增PCV ORF2的引物为：H1：5’-ATCGCTAGCGCCGCCACCATGACGTATCCAA-3’    Nhe IH2：5’-GCCGCGGAATTCTCACTTAGGGTTAAGT-3’       EcoR I预期扩增长度为702bp；加粗部分为Kozak序列扩增PRRSV ORF5的引物为：Y1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’   Xba IY2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’    Not I预期扩增长度为702bp；加粗部分为Kozak序列在每条引物的5’端均含有限制性内切酶酶切位点，分别以PRRSV SD1株的cDNA和PCV2SD1株的DNA为模板，通过引物Y1/Y2扩增PRRSV ORF2，通过H1/H2扩增PCV2 ORF2基因；以PCV SD1株的DNA为模板，应用RT-PCR技术扩增ORF2全基因，通过每对引物的限制性酶切位点，把ORF5及ORF2分别插入pIRES两个不同的多克隆位点中，产生pIRES-ORF2/ORF5重组质粒，该质粒经酶切及PCR鉴定2)pIRES-ORF2/ORF5真核重组表达载体的构建将PCR产物ORF2经双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR产物ORF5经双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建成重组质粒pIRES-ORF2/ORF5，经PCR、RT-PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功构建了转移载体pIRES-ORF2/ORF5；3)pIRES-ORF2/ORF5真核重组质粒的转染将构建成功的pIRES-ORF2ORF5重组质粒用脂质体法转染真核细胞Marc-145，经G418加压筛选获得稳定表达的细胞株，以PCR、RT-PCR、和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况，证明：经PCR、RT-PCR检测到两种目的基因的转录；间接免疫荧光试验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。