海水鱼弧菌高效疫苗的制备

摘要

一种海水鱼弧菌高效疫苗的制备，该弧菌高效疫苗是溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌中的两种或两种以上灭活细菌科学配伍构成。它们是从各类发病海水鱼体内分离纯化而来，并筛选出毒力强、免疫原性强的菌株，以生物反应器优化培养后，再进行科学控制灭活处理，最后按等比例混合后得到相应的弧菌高效疫苗：现场使用推荐采用连续注射免疫方式。本发明所制备的弧菌高效疫苗，能有效抵抗各种鱼类致病弧菌的侵染。其制备和使用方便，安全可靠，且免疫效果好，免疫保护率可达80-95％，生产易于产业化，在海水鱼养殖中应用前景非常广阔。

主权项

一种海水鱼弧菌高效疫苗的制备方法，其中弧菌菌种包括：溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌，其特征在于：该制备方法主要是弧菌菌株的分离纯化、液体的活化培养、生物反应器的扩大培养、培养物的灭活和洗涤及疫苗的混合；所述海水鱼弧菌高效疫苗的制备方法按以下步骤：(1)将分离纯化于各种发病海水鱼的强毒力和强免疫原性的溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌分别接种到含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，28±0.5℃培养24小时；(2)分别将步骤(1)固体培养基上培养好的菌体，接种到已经高压灭菌并盛有含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基的锥形瓶中，在振荡摇床中进行小体积的液体活化培养，培养温度28±0.5℃，摇床转速100-200转/分，培养时间为12-24小时；(3)按1％的比例将步骤(2)中培养好的菌体接种到生物反应器中已经高压灭菌的含1.5-2％Nacl的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，培养温度为28±0.5℃，搅拌速度为400-600转/分，培养时间为18-24小时，当弧菌生长到高峰，停止反应；(4)取出步骤(3)培养的菌液，加入0.5-1％福尔马林溶液，4℃搅拌灭活24-48小时；(5)取出灭活的菌液在冷冻离心机中，于4℃下6000-8000转/分离心10-20分钟，收集沉淀；(6)沉淀用浓度0.01mol/L，pH7.2的无菌磷酸盐缓冲液PBS或含0.85％Nacl的盐水悬浮，再用6000-8000转/分离心10-20分钟，如此重复3次以去除福尔马林；(7)将最后的离心所得的沉淀用浓度0.01mol/L，pH7.2的无菌磷酸盐缓冲液PBS或含0.85％Nacl的盐水悬浮，稀释成浓度为1×109- 5×109个/毫升；(8)最后根据海水鱼发病规律，选择以上各种灭活菌其中的2种或2种以上，以等比例混合制成弧菌高效疫苗。