一种全长cDNA均一化消减杂交方法

摘要

本发明提供了一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：(1)第一链cDNA的合成；(2)双链cDNA的合成；(3)选择性连接和引物延伸；(4)消减杂交；(5)PCR扩增差异表达的cDNA。消减杂交的PCR产物可以直接克隆到载体上，构建差异表达基因富集的cDNA文库，利用这些文库分析基因表达，也可以制备基因芯片，还可以标记为探针，从已有文库中筛选差异表达的基因。此外如果消减效率不够高，还可以把消减杂交的PCR产物重复进行消减杂交，提高均一化和消减效率。本发明所述的全长cDNA均一化消减杂交(FNSH)方法的有益效果主要体现在：对差异基因的高消减效率，对差异表达基因的高效富集，高效均一化，并且得到全长cDNA。

主权项

1.一种全长cDNA均一化消减杂交方法，所述方法包括以下顺序步骤：(1)第一链cDNA的合成：选取含有差异表达基因的两组样品：特有的或差异表达基因表达较高的样品为tester，没有或差异表达基因表达较低的样品为driver，抽提样品的总RNA，分别利用模板转换技术进行逆转录，分别合成tester和driver的第一链cDNA，分别命名为tester1和driver1；所述逆转录按如下方法进行：分别将1～2μg总RNA，1μL10mM的dNTPs，1μL10μM TSCAP1，及1μL10μM TSPA混合，在65℃下放置3分钟后，在冰上冷却后加入2μL5×第一链合成缓冲液，0.25μL RNaseInhibitor以及0.75μL逆转录酶MMLV-RT H^-，加灭菌的DEPC处理水补足到10μL总体积后在42℃放置1.5小时使逆转录完成，最后加入0.5μl0.2mMEDTA来螯合Mn²⁺，并加入70μL无菌去离子水；所述5×第一链合成缓冲液组成为：250mM Tris-Cl pH8.3，375mM KCl，30mM MgCl₂，10mM MnCl₂，50mM DTT；(2)双链cDNA的合成：将tester1分为两组tester1-1、tester1-2，tester1-1利用引物3’AP和5’磷酸化引物PH5’CP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到有义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester2-1；tester1-2利用引物5’CP和3’磷酸化引物PH 3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA，得到反义链上5’末端磷酸化的双链cDNA：tester 2-2；driver1利用引物5’BK和3’BK或者引物5’CP和3’AP，通过PCR扩增合成双链cDNA：driver2，所述引物5’CP和PH5’CP的序列一致且都与步骤(1)中的TSCAP1相对应，3’AP和PH3’AP的序列一致且都与步骤(1)中的TSPA相对应，5’BK的3’末端含有与5’CP相同的序列，引物3’BK的3’末端含有与3’AP相同的序列；(3)选择性连接和引物延伸：将tester2-1和tester2-2分别用非磷酸化的接头ADP I和ADP II进行连接，得到连接产物tester3-1和tester3-2；driver2分为两组：driver2-1、driver2-2，所述的driver2-1、driver2-2分别采用引物5’BK和3’BK，在PCR条件下进行3～5个循环，分别得到单链cDNA富集的driver3-1和driver3-2；(4)消减杂交：分别将tester3-1和tester3-2与过量的driver3-1和driver3-2在杂交缓冲液中混合，并加入引物TSCAP2和TSPA，热变性后，65～68℃下放置4～12小时，使tester和driver的cDNA进行充分杂交；将杂交产物混合在一起，65～68℃下继续放置8～16小时，得到含有两端各自为接头ADP I和ADP II的异源杂交子的杂交产物；(5)PCR扩增差异表达的cDNA：将杂交产物补平末端后，利用与ADP I和ADP II相匹配的引物进行选择性的PCR扩增，富集差异表达的cDNA；所涉及引物序列如下：5’CP：5’--3’PH5’CP：5’-p-3’3’AP：5’--3’PH3’AP：5’-p-3’ADP I：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTGTAGCGTGAAGACGACAGAATTCTTAAGGTAGCT-3’3’-AGAATTCCATCG-5’ADP II：5’-GTA ATACGACTCACTATAGGGCTGCAGGGAACCAATCCTCTCTTAAGGTAGCT-3’3’-AGAATTCCATCG-5’5’BK：5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’3’BK：5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’TSCAP1：5’-G-p-3’TSCAP2：5’-G-3’TSPA：5’-T)15VN-3’。