一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，属于菊花育种与蛋白质组学领域。该方法包括：以栽培小菊作母本，野菊菊花脑作父本开展远缘杂交工作。授粉后不同时间剪下已授粉的花序，分别取形态发育完整、饱满的子房和形态发育异常、不饱满的子房，取样后立即在液氮中速冻后保存于-80℃冰箱中。样品用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，保存于-80℃。最后运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析，获得与菊花远缘杂交育种中胚胎败育的相关蛋白。本发明针对菊花及其近缘属野生种，提供了一种快速、准确鉴定菊花胚胎发育过程中不同发育阶段的不同形态的胚胎差异蛋白，为解决菊花远缘杂交胚胎败育提供研究基础。

主权项

一种鉴定菊花远缘杂交胚胎败育相关蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：   1）以栽培菊花作母本，野菊作父本进行远缘杂交，分别于授粉后12 d和18 d剪下已授粉的花序进行取样，授粉后12 d时取发育正常、饱满的子房，授粉后18 d时分别取发育正常、饱满的子房及发育异常、不饱满的子房；取样后立即在液氮中预处理1~2 h，然后于‑80℃贮存；2）将步骤1）所取得的样品分别用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白质，得到授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质，于‑80℃保存；3）将授粉后12 d发育正常饱满子房的蛋白质、授粉后18 d发育正常饱满子房的蛋白质和发育异常不饱满子房的蛋白质分别运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白，并进行生物信息学分析；步骤3）中运用iTRAQ与质谱技术快速鉴定差异蛋白主要包括以下步骤：样品前处理、第一维高pH反相色谱分离和第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集，在利用生物信息学手段对数据分析基础上，获得与胚胎败育密切相关的蛋白；所述的样品前处理包括以下步骤：蛋白定量、蛋白纯化、蛋白酶解、肽段iTRAQ标记、去除残留标记试剂、脱盐；所述的第一维高pH反相色谱分离的过程为：将样品前处理后得到的肽段粉末使用高pH流动相A溶解上样，使用梯度洗脱，0‑30 min，流动相由5%B升至35%B；30‑32 min，由35%B升至80%B；32‑35 min保持80%B，35‑36 min由80%B降至5%B，并保持14 min平衡色谱柱，高pH反相梯度共50 min；流速为200 µl/min，色谱柱保持在室温条件，使用紫外214 nm波长检测；色谱系统死时间为2 min，由4 min开始每隔2 min使用EP管收集馏分，最后第32‑36 min收集为一管，共计收集15管，分别干燥成肽段粉末；所述的高pH流动相A为20 mM甲酸铵，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH；高pH流动相B为20 mM甲酸铵，90%乙腈，pH=10.0，色谱纯氨水调节pH；所述的第二维低pH反相色谱质谱联用数据采集的过程为：1）将第一维高pH反相色谱分离得到的肽段干粉使用流动相A溶解，溶解后上样；2）上样流速为20 µl/min，上样5 min，肽段直接被捕集柱捕集；3）经过阀切换，使捕集柱和分析柱相连，同时启动Nano泵进行RP分离，启动质谱采集在线检测肽段；4）100 min内从5% B升至40% B，5 min内B从40%升至80%，然后1 min内B降至5%，以5%的B平衡色谱柱14 min，反相过程共120 min，流速为500 nL/min，色谱柱温度为35℃；所述的流动相A：5%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH；流动相B：90%乙腈，0.1%甲酸水溶液，pH=2.5，色谱纯甲酸调节pH；质谱条件：离子源喷雾电压为1.2 kV，LTQ Orbitrap XL质谱仪加热毛细管设定为200℃，采用数据依赖模式自动在MS和MS/MS间切换采集，全扫描MS使用Orbitrap进行质心模式扫描，扫描范围为m/z 400‑1800，m/z 400处的分辨率设定为30,000，线性离子阱离子最大引入时间为200 ms，自动增益控制设定为1x10⁶，随后使用高能碰撞解离对符合串级碎裂条件的母离子进行碎裂并用orbitrap进行扫描，扫描分辨率设定为7500，扫描范围根据母离子质荷比自动控制，最低扫描范围固定为m/z=100处，最高到2000，对强度排名前6的离子进行MS/MS并进行Centroid模式扫描，进行MS/MS的最低离子强度值设定为8000，MS/MS时LTQ离子最大引入时间为800 ms，自动增益控制设定为2×10⁵，母离子选择窗口设定为3道尔顿，对于单电荷和未知电荷数的离子不进行MS/MS采集，动态排除设定为每个母离子在10 s内进行2次MS/MS，之后排除180 s，排除窗口为母离子质荷比前10 ppm，母离子质荷比后30 ppm，MS/MS使用高纯氦气，40%的碰撞能量，碰撞反应40 ms。