一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒，该方法采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，同时采用选择性培养目的病原菌和特异性引物来提高检测效率。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、稳定性好、特异性强的优点，而且操作简单，不需要提取DNA。

主权项

一种定量检测土壤中青枯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1mL，控温30℃，用SMSA发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液； （2）取2μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR扩增反应，引物序列为：P1：5’‑CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG‑3’，P2：5’‑CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT‑3’；（3）同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果；（4）统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算青枯菌个数；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度/土壤干重百分比。