抗体与微珠连接方法

摘要

本发明公开了一种抗体与微珠连接方法，包括抗体与核苷酸交联，核苷酸与微珠结合，核苷酸互补链杂交等流程。抗体与核苷酸交联包括抗体的修饰与脱盐、核苷酸的修饰与脱盐、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化等步骤。本发明是以双功能基团为核苷酸和抗体作修饰，通过醛基与氨基使其结合形成腙键结合。在本发明中，核苷酸与微珠的结合是由微珠上包被的亲和素与核苷酸链上修饰的生物素特异性吸附完成的；核苷酸互补链杂交通过特定的杂交液在一定温度条件下完成；通过Cy3标记的二抗等在特定温度条件下孵育鉴定微珠上反应是否成功。本发明以寡核苷酸作为“支撑臂”，将抗体与磁珠表面隔开一定距离，有利于避免抗体遭结构破坏，保护抗体活性。

主权项

抗体与微珠连接方法，其特征是包括以下步骤：1)、抗体与核苷酸交联：A、抗体的修饰与脱盐：50μg免疫球蛋白稀释成浓度为6mg/mL后与SANH均匀混合后，于25℃的摇床中孵育修饰4小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为60：1；将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH；得脱盐后的抗体修饰产物；B、核苷酸的修饰与脱盐：用pH 7.4的磷酸缓冲液将核苷酸稀释至10mg/mL，加入SFB均匀混合，于25℃的摇床中孵育修饰4小时，SFB与核苷酸的摩尔比为60：1；核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA(5’～3’)，3’端修饰了氨基；将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB；得脱盐后的核苷酸修饰产物；C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化将脱盐后的抗体修饰产物和脱盐后的核苷酸修饰产物按照1:10的摩尔比均匀混合，于4℃充分反应12小时，将所得的交联后产物经洗涤、离心、过滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体—核苷酸交联体；2)、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：微珠先经洗涤液洗涤，然后静置；将2×10^‑11mol biotin修饰的核苷酸加入5μl的Neutravidin包被的磁珠，于25℃的摇床孵育15分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述8.5×10^‑13mol纯化后的抗体—核苷酸交联体，在pH 6.0的6×SSPE缓冲液条件下于25℃的摇床孵育2小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系；所述核苷酸的序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC 5’～3’,3’biotin修饰；所述洗涤液为将BSA用pH 7.4的PBS溶液稀释至质量浓度为0.1～0.5％而得。