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一种二倍体泥鳅微卫星家系鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：1)选择健康发育良好的二倍体泥鳅作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取每个亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，于‑20℃保存备用；2)利用醋酸铵法提取二倍体泥鳅亲本和子代的基因组DNA，具体方法如下：将每个亲本的鳍条组织和每个子代全鱼去头和内脏放于2ml的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液，在每个管中加入浓度为20mg/L的蛋白酶K 8μL，放入65℃水浴锅中水浴2‑4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解；将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却10min，12,000rpm 4℃离心10min，取上清液至新离心管；加入与上清液等量的异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1‑2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇；加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm 4℃离心10min，弃去70％的酒精；加入无水乙醇，12,000rpm 4℃离心10min，弃去无水乙醇，室温干燥20min，加入50μL双蒸水溶解DNA；用NanoDrop ND‑1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL；3)多态性微卫星标记的筛选和引物的合成：选取8对微卫星引物，按照片段大小分为三组，第一组Mac133、Mac429、Mac37，第二组Mac477、Mac605、Mac456，第三组Ma112、Mac449，在正向引物的5’端分别用FAM、ROX、HEX三种不同的荧光基团进行修饰，用于PCR分析；4)采用荧光PCR反应对亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤3)中所选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS‑500LIZ作为内参，用GeneMapper 3.5软件读取每个样品的基因型；5)采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，步骤3)所述的8对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：Mac133 F:CTGCATGCTCTTGCATAGGA R:CATTCATATTCCACCCTCTCGMac429 F:TATGTGAGGAAGATAAGCAG R:GAATCCAGATCAAAGCAATCMac37 F:GCAAGTACATGCTCATCCTT R:CACCTGCATTCCTTACATCTMac605 F:ATTCTGAAGGTCACCGTTGT R:GCAGCCGTTAATACACTGTCMac477 F:CTGAGACTCTTTATGTCTCAC R:CTATCAAGGGAACTGAATGGMac456 F:TCTCCTCTGACACCATCAGG R:GTACGGACACGAGTCTGGAAMa112 F:AGATGTACTGCACTTTCTTTA R:GAATAGCCTATATGTAAATGTMac449 F:CCCTCCACTTCAACCCTACA R:GACCCTGCTGTCATCTCACA。 |
