大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物

摘要

本发明的目的在于提供一种大规模筛查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物，所述方法通过荧光PCR直接判断有无曲线增长或观察荧光PCR后的溶解曲线，从而判断是否存在CCR5-Δ32基因型，以及该基因型是否是纯合子或杂合子，从标本加样到完成荧光PCR反应及结果判断，在1个半小时内完成，同时避免了PCR方法最大的缺点，即产物的污染问题，使得结果更准确可信，因此该方法非常适合对标本的大规模初筛。同时可以采用初筛和复查相结合的策略，既在初筛的基础上，可对疑似CCR5-Δ32基因型的标本，进行测序验证，从而保证结果的可靠性。该方法具有快速、准确、简单、成本低、能大规模进行筛选的优点，有利于基层现场的使用和推广。

主权项

一种大规模筛查CCR5‑Δ32基因型的方法，其特征在于，步骤如下：(1)、标本采集；(2)、标本DNA提取、保存；(3)、构建CCR5野生型和CCR5‑Δ32基因型的阳性质粒：在荧光PCR扩增之前构建CCR5野生型和CCR5‑Δ32基因型的阳性质粒，用作荧光染料PCR法溶解曲线分析法中的阳性对照，其中：CCR5野生型：通过引物SEQ ID No：1和SEQ ID No：2对正常人的DNA进行PCR扩增，其产物直接采用TA克隆的方式，获得CCR5野生型阳性质粒；CCR5‑Δ32基因型：采用一对快速突变基因位点的引物将CCR5野生型质粒直接转变成CCR5‑Δ32基因型质粒，引物的序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；完成CCR5‑Δ32基因型阳性质粒的构建后，均作测序验证；(4)、对CCR5‑Δ32基因型进行初筛，收集结果为阳性的标本进行下一步验证：a、PCR扩增：用于染料法荧光PCR扩增的引物为一对围绕CCR5‑Δ32区域的特异性引物，分别为正向引物SEQ ID No：1和反向引物SEQ ID NO：2；b、溶解曲线分析：扩增后加上溶解曲线分析程序进行溶解曲线的分析，其中标本的溶解温度在76.0‑78.0℃之间的是纯合野生型，溶解温度在73.0‑75.0℃之间的是纯合CCR5‑Δ32基因型，如标本的溶解曲线出现两个峰值，溶解温度分别在纯合野生型和纯合CCR5‑Δ32基因型的温度范围内，则该标本为CCR5‑Δ32杂合基因型；其中，在进行溶解曲线分析时，标本的溶解温度与CCR5野生型阳性质粒相同的是纯合野生型，溶解温度与CCR5‑Δ32基因型阳性质粒相同的是纯合CCR5‑Δ32基因型，如标本的溶解曲线出现两个峰值，溶解温度分别与CCR5野生型和CCR5‑Δ32基因型阳性质粒相同，则该标本为CCR5‑Δ32杂合基因型；(5)、对CCR5‑Δ32基因型进行进一步筛选，收集结果为阳性的标本进行下一步验证：c、PCR扩增：用三条引物进行染料法荧光PCR扩增，它们分别是：共同的反向引物，序列为SEQ ID No：5；野生型CCR5正向引物，序列为SEQ ID No：7或SEQ ID No：9；和CCR5‑Δ32基因型正向引物，序列为SEQ ID No：11；这三条引物按正反向引物两两配对，分别配成两个独立的反应管，加入荧光染料，再将同一标本分别加入这两个反应管中，放置于荧光PCR仪中进行反应；d、结果分析：用有无扩增曲线来直接判断是否为CCR5‑Δ32基因型，仅野生型引物的反应管有扩增，即为CCR5野生型，仅有CCR5‑Δ32型引物的反应管有扩增，即为CCR5‑Δ32纯合型，两个管均有扩增，则为CCR5‑Δ32杂合型；(6)、对CCR5‑Δ32基因型进行进一步筛选，收集结果为阳性的标本进行下一步验证：在配制反应混合液时，用荧光探针替代了荧光染料来进行PCR扩增，即采用Taqman探针荧光PCR法筛查CCR5‑Δ32基因型，所述探针是SEQ ID No：12，序列为5’－CTGGTCCTGCCGCTGCTTGTC－3’，其中5’端的荧光报告基团是FAM、HEX、JOE、TET或VIC中的任意一种，3’端的荧光淬灭基团是TAMRA、BHQ‑1或Iowa Black中的任意一种；(7)、对CCR5‑Δ32基因型进行最终筛选：采用DNA测序法筛查CCR5‑Δ32基因型，所用两条引物的序列为SEQ ID No：13和SEQ ID NO：5；其扩增后的片段经2.5％凝胶电泳，割胶纯化后可直接测序。