一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法

摘要

一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，属于生物制剂检测技术领域。其包括以下步骤：根据茶刺蛾核型多角体病毒的Lef 11基因设计引物；获取目的片段，进行PCR扩增得到Lef 11基因片段；构建重组质粒；建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线；提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。本发明突破了传统的生物测定技术，解决了茶刺蛾核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶刺蛾核型多角体病毒的生产应用。

主权项

一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）根据茶刺蛾核型多角体病毒的Lef 11基因设计引物IrfaNPV Lef 11 F和引物IrfaNPV Lef 11 R，所述的引物IrfaNPV Lef 11 F核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的引物IrfaNPV Lef 11 R核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；2）从感染茶刺蛾核型多角体病毒的虫尸中提取茶刺蛾核型多角体病毒基因组DNA，获取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到Lef 11基因片段；3）将步骤2）扩增获得的Lef11基因片段与载体pGEM‑T连接，转化入大肠杆菌DH5a中，挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序并测定质粒标准品浓度，保存于‑20℃冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；4）将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线；5）提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4）中建立的标准曲线求出待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。