PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用

摘要

PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒及其构建方法与应用，涉及一种重组质粒。所述构建方法：1)将PSG5-Myc-Fbw7质粒谱图信息与PcDNA3.1(+)质粒谱图信息比较，确定双酶切位点EcoR Ⅰ和NotⅠ；2)双酶切PSG5-Myc-Fbw7质粒；3)双酶切PcDNA3.1(+)质粒载体；4)通过琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效率，将质粒载体PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全长进行连接；5)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，抽提PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒。所述PcDNA3.1(+)-Fbw7重组质粒可用于制备治疗人胆管癌肿瘤药物。

主权项

PcDNA3.1(+)‑Fbw7重组质粒，其特征在于是通过提取人Fbw7基因全长，以含新霉素筛选标签的PcDNA3.1(+)质粒为载体，在PcDNA3.1(+)的和限制性酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间插入Fbw7基因全长，构建的一种含Fbw7基因全长和新霉素筛选标签的PcDNA3.1(+)‑Fbw7重组质粒；所述PcDNA3.1(+)‑Fbw7重组质粒由以下方法构建：1)将PSG5‑Myc‑Fbw7质粒谱图信息与PcDNA3.1(+)质粒谱图信息比较，确定双酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ；2)双酶切PSG5‑Myc‑Fbw7质粒，具体反应体系如下：PSG5‑Myc‑Fbw7 1μg，EcoR Ⅰ 1.0μL，Not Ⅰ 1.0μL，1×H 2.0μL，BSA 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；3)双酶切PcDNA3.1(+)质粒载体，具体反应体系如下：PcDNA3.1(+) 1μg，EcoR Ⅰ 1.0μL，Not Ⅰ 1.0μL，1×H 2.0μL，BSA 2.0μL，灭菌超纯水补至20μL，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；4)通过琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效率，将质粒载体PcDNA3.1(+)和目的基因Fbw7全长进行连接，具体反应体系如下：10×反应缓冲液1.0μL，PCDNA3.1(+) 2.0μL，Fbw7 6.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，各组份混匀后，16℃金属浴中连接过夜；5)将重组质粒转化感受态细菌，筛选阳性克隆，并进行测序鉴定，如鉴定结果为阳性克隆，则抽提PcDNA3.1(+)‑Fbw7重组质粒；所述测序鉴定的具体方法为：用第1对引物进行菌落PCR扩增，对扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，如所得DNA片段长度为244bp，则鉴定为阳性克隆，所述第1对引物为：正向引物：5’‑ctacccaaaagtaatcatcttaagtg‑3’；反向引物：5’‑cccaaccatgacaagattttcc‑3’；用第2对引物进行菌落PCR扩增，对扩增后所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，如所得DNA片段长度为278bp，则鉴定为阳性克隆，所述第2对引物为：正向引物：5’‑tttctgtttctccctctg‑3’；反向引物：5’‑gagcatttaagggagagataagag‑3’；6)将步骤5)所述抽提的PcDNA3.1(+)‑Fbw7重组质粒进行DNA测序分析，选取双向测序模式，使用PcDNA3.1(+)质粒通用引物横跨质粒的多克隆位点区逐个碱基检测，检测结果与Fbw7序列进行比对。