一种铅离子快速检测金标试纸条或卡

摘要

本发明公开了一种用于快速检测铅离子的金标试纸条/卡，包括底层支撑板(1)、样品垫(2)、金标抗体结合垫(3)、纤维素膜(4)、吸水垫。本发明可以实现对环境、土壤、水、食品、药物、化妆品中铅离子污染残留的快速检测。

主权项

一种用于快速检测铅离子的金标试纸条，包括底层支撑板(1)、样品垫(2)、金标抗体结合垫(3)、纤维素膜(4)、吸水垫(5)，其特征在于：所述试纸条是以底层支撑板(1)为底部支撑，将样品垫(2)、金标抗体结合垫(3)、纤维素膜(4)、吸水垫(5)和包被膜依次粘贴于底层支撑板(1)上，所述底层支撑板(1)和外卡均由硬质塑料制成，所述样品垫(2)与金标抗体结合垫(3)以玻璃纤维棉为基质，所述金标抗体结合垫(3)包被有胶体金标记的能识别铅离子的单克隆抗体；所述纤维素膜(4)中部依次平行排列有隐形检测线(T线)和质控线(C线)，检测线包被有铅离子与载体蛋白通过螯合剂形成的偶联物，质控线包被有兔抗鼠IgG(RaMIgG)；所述的螯合剂选自异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、还原谷胱甘肽(GSH)中的一种；所述载体蛋白选自鸡卵清白蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)中的一种；所述的偶联物为Pd²⁺‑ITCBE‑OVA，所述的金标试纸条通过包括如下步骤在内的方法制备得到：(1)称取20mg OVA溶于1mL pH9.0的10mM/L的HEPES缓冲液中形成20mg/mL的载体蛋白溶液；(2)称取10mg ITCBE溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中形成金属螯合剂溶液；(3)将0.5mL金属螯合剂溶液逐滴加到OVA载体蛋白溶液中，混匀后，加入100μL 1.5M的三正丁胺，摇床室温反应24h，制成OVA‑ITCBE溶液；(4)取11.25mg硝酸铅(Pb(NO₃)₂)溶于100μL蒸馏水中，形成均匀的Pb²⁺溶液；(5)将Pb²⁺溶液加入到OVA‑ITCBE溶液中，调节pH值至7.4，在室温下，摇床孵育4h，然后移入透析袋中PBS透析10d，即形成Pb²⁺‑ITCBE‑OVA，收集分装，‑20℃冻存；(6)胶体金溶液制备：采用柠檬酸盐还原法制备，取1000mL三角烧瓶，加入975mL双蒸水煮沸，加入15mL柠檬酸三钠继续加热5min，加入10mL1％氯金酸，继续加热至溶液呈现橘红色，冷却至室温后，4℃保存备用；(7)单克隆抗体制备：用铅离子‑螯合剂‑载体蛋白免疫小鼠，以Pb²⁺‑ITCBE‑OVA为例，说明如下：用Pb²⁺‑ITCBE‑OVA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为50μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射；选择细胞融合备用小鼠，间接ELISA检测抗血清中Pb²⁺螯合物pAb效价，阻断ELISA检测Pb²⁺‑ITCBEpAb对Pb²⁺‑ITCBE的IC₅₀，挑选效价最高、IC₅₀最低的小鼠，超免用于细胞融合，采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在pH8.0的50％PEG作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化；分别于冻存15d、30d和60d后复苏杂交瘤细胞，培养后取上清液，间接ELISA测定抗体效价，考察杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的稳定性，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Pb²⁺‑ITCBE‑OVA mAb，取8周龄健康Balb/c雌性小鼠，腹腔注射FIA0.5mL/只，10～15天后使用；将培养的阳性杂交瘤细胞1000rpm离心10min弃上清，收集细胞沉淀；用灭菌的PBS将细胞沉淀悬浮、混匀，将细胞数调至10⁶/mL，腹腔注射Balb/C小鼠0.5mL/只；接种细胞7‑10天后产生腹水，进行收集，于37℃水浴30min，4℃放置过夜，12000rpm离心5min，弃去上层的脂肪、IFA和下层的沉淀，饱和硫酸铵盐析法提纯后测定IgG含量和效价，‑20℃保存备用；(8)金标抗体制备：将待标单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；根据聚沉现象，确定铅离子‑螯合剂‑载体蛋白mAb与胶体金溶液最适标记浓度，Pb²⁺‑ITCBE‑OVAmAb为0.175mg/mL；取胶体金溶液10mL，用0.1mol/L K₂CO₃溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量的浓度为0.175mg/mL单克隆抗体溶液，磁力搅拌下混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，沉淀物用含10g/L OVA、0.5g/L叠氮钠的0.02mol/L Na₂B₄O₇溶液稀释，4℃保存备用；(9)金标抗体结合垫制备：裁取规格为20×4mm的玻璃纤维棉，将金标抗体用X‑only单向喷点仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；(10)硝酸纤维素膜上检测线、质控线制备：将浓度为1mg/ml的铅离子‑螯合剂‑载体蛋白放于X‑only单向喷点仪贮存池A，浓度为1mg/ml的RaMIgG放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5cm的检测线和质控线，自然干燥，密封，4℃保存备用；(11)金标试纸条组装：将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴于支撑板上，并在样品垫与金标抗体结合垫表面粘贴MAX线，在切槽机上切割成宽度4mm的金标试纸。