杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒中含有特异性引物HSHRV-2F、HSHRV-2R和探针HSHRV-2 probe，将该试剂盒用于检测杂交鳢弹状病毒，具有灵敏度高、重复性强、特异性好的特点，能够快速、准确地对杂交鳢弹状病毒进行定性和定量，对于杂交鳢病毒病的早期诊断、分子流行病学研究以及防控技术研究等具有重要意义。

主权项

杂交鳢弹状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组份：（1）荧光定量PCR引物HSHRV‑2F、HSHRV‑2R和探针HSHRV‑2 probe；（2）荧光定量PCR反应液；（3）阳性对照；（4）阴性对照；其中，所述荧光定量PCR引物和探针的核苷酸序列如下：HSHRV‑2F：5'‑CACCAGTCATATCAATCC‑3'              （SEQ ID NO.3）；HSHRV‑2R：5'‑CGGACTTAAACCTCATTC‑3'             （SEQ ID NO.4）；HSHRV‑2 probe：5'‑ACCTCTCCGCACATTGACATCT‑3'     （SEQ ID NO.5）；所述阳性对照，其制备方法包括以下步骤：提取杂交鳢弹状病毒总RNA，反转录获得cDNA，然后以cDNA为模板，以P1、P2为引物，进行PCR扩增，将回收纯化的扩增产物作为阳性对照；其中，引物P1的核苷酸序列为5'‑CGCGGATCCATCATGAAATCAATCATTGCACT‑3'（SEQ ID NO.1），引物P2的核苷酸序列为5'‑CATCTGCAGAATTGATACTGCTGCAAAGGG‑3'（SEQ ID NO.2）；将扩增产物连接到pMD18‑T载体，以阳性克隆的重组质粒作为阳性对照；所述荧光定量PCR反应液含有Premix Ex Taq^TM，ROX Reference Dye Ⅱ；所述阴性对照为ddH₂O；所述探针的5'端标记荧光染料FAM，3'端标记淬灭基团BHQ。