鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法

摘要

本发明是申请号为201110192093.9的分案申请。属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及鮸鱼EST微卫星标记的特异引物及筛选方法。所述微卫星标记的特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.20所示。本发明建立了一种筛选方式，可方便快捷的用于做鮸鱼种质资源和遗传多样性的分析，分子种群遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱构建和功能基因的研究，进一步用于鮸鱼的分子设计育种和资源调查。

主权项

一种鮸鱼EST微卫星标记的筛选方法，其特征是首先利用从鮸鱼cDNA文库中测序获得的EST序列，利用微卫星检索软件Tandem Repeat Finder进行微卫星位点的查找，对于2‑6个碱基重复单元重复次数依次大于7，5，4，3次的微卫星片段进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到EST微卫星标记，其中，所述的筛选到的EST微卫星标记的特异引物为：Mimi‑13‑G10：F:GCGACAACGCAGACAGGA，R:CTTGGGCGGATGGTAGGA，所述的然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异引物，具体操作为：在微卫星重复区的侧翼序列利用软件Primer Premier 5.0设计引物，引物要求满足以下条件：⑴ 引物长度为18‑25bp; ⑵GC含量大于40%；⑶ 退火温度大于40°C，且正反引物退火温度相差不超过5°C；⑷ 预期的PCR产物长度为100‑300bp；⑸尽量避免二级结构，所述的并进一步检测优化引物成为微卫星标记，具体操作为：（A）引物的优化：各引物的最佳退火温度在预期退火温度上下浮动10°C之间进行优化，直至预期目的产物能被清晰稳定的扩增，PCR扩增的反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟；反应体系为：总体积20μl，其中含有内含1.5mM Mg²⁺ 的1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1U Taq聚合酶，模板量为50‑100ng；模板是随机的两个鮸鱼个体的DNA混合池；扩增得到的产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳‑EB染色系统进行检测，选择单一或杂带少、特异性产物较高的温度作为最佳退火温度，（B）微卫星位点的确定：根据步骤（A）中优化的退火温度选取30个个体检测这些微卫星标记的多态性，PCR反应程序为：95°C变性5分钟之后进入循环，95°C变性30秒，退火温度退火30秒，72°C延伸30秒，进行30个循环，最终72°C延伸5分钟；反应体系为：总体积20μl，其中含有内含1.5mM Mg²⁺的1×PCR buffer，0.2μM dNTP，1UTaq聚合酶，模板量为50‑100ng；PCR扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒压1000‑1500V，功率200W，电泳1‑2个小时，硝酸银染色系统进行检测，干燥后分析确定多态性，最后筛选出鮸鱼微卫星标记。