一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法

摘要

本发明一种大豆抗原β-conglycinin的检测方法，建立一种检测大豆抗原β-conglycinin直接ELISA方法。由方阵实验确定包被抗原为1μg/mL，抗体最适稀释度1：400，由正交响应面实验设计确定最佳封闭时间为58.31min，酶标抗体最佳反应时间为139.16min，底物液作用最佳反应时间为19.43min，灵敏度达1ug/ml，线性检测范围在20ng/ml～640ng/ml之间。板间变异系数(CV％)的平均数为8.16％，板内变异系数(CV％)的平均数为6.91％，交叉反应小于20％。本发明检测方法具有样品前处理相对简单、快速、成本低、仪器化程度低、耗时短等特点，可应用于大豆及其深加工产品中大豆球蛋白含量的检测，适用于现场监控和大量样本筛查。

主权项

一种大豆抗原β‑conglycinin的检测方法，所述检测方法为直接ELISA检测方法，其特征在于，步骤为：1)包被样品：用包被缓冲液稀释成浓度为20ng/ml～640ng/ml的β‑conglycinin，同时做空白孔和阴性对照孔，在底板的反应孔中加100μl，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤ELISA反应板3‑5次，每次3min～5min；2)封闭：每孔加入封闭液于37℃封闭1h，同上洗涤三次；3)加样：加入不同浓度的β‑conglycinin多克隆抗体与相应的抗原结合，每孔100μl，置37℃孵育1h，然后洗涤；4)加酶标二抗：将酶标二抗用抗体稀释液稀释5000倍，取100μl加入不同反应孔中，37℃孵育1h，洗涤；5)加底物液显色：于各反应孔中加入配制好的TMB底物溶液100μl，37℃反应15min～25min；6)终止反应：加2M硫酸，每孔50ul，终止ELISA显色反应；7)读取OD值：在酶标仪上，于492nm处，测各孔OD值，以阳性对照约为1.0，阴照小于0.1，且阳性/阴性(P/N)≥2的条件作最适条件，据此选择包被抗原和一抗体的工作浓度。