杀死烟曲霉菌的组合物及方法

摘要

一种杀灭烟曲霉菌的组合物和杀死烟曲霉菌的方法，属于生物技术领域。杀灭烟曲霉菌的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉菌生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用、XTT减低法测代谢活性、荧光染液的配制和荧光染色及观察，用绿原酸和伏立康唑联合杀死烟曲霉菌。本发明提供的一种杀死烟曲霉菌的组合物及方法，能够杀死生物膜中的烟曲霉菌丝，解决抗真菌药物无法杀死生物膜中的烟曲霉菌的难题。

主权项

一种体外杀灭烟曲霉菌的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、制备烟曲霉菌生物膜载体、药物对烟曲霉生物膜作用、XTT减低法测代谢活性、荧光染液的配制和荧光染色及观察，其特征在于，用绿原酸和伏立康唑联合杀死烟曲霉菌，具体步骤如下：1）制备药物 取400~500mg绿原酸和4~5mg伏立康唑，分别用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，分别配制成浓度为102400μg/ml和1280μg/ml的溶液，于‑20℃~‑25℃储存；2）收集菌株 收集烟曲霉菌株，质控菌株为近平滑念珠菌；3）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行高温高压灭菌，作为载体；4）制备孢子悬液 将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一个PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~3×10⁶·孢子·ml^‑1，再用RPMI‑1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；5）药物敏感试验 微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤4）制备的孢子悬液，再将步骤1）制备的绿原酸和伏立康唑分别置于两个无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI‑1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h；获得绿原酸和伏立康唑最低抑菌浓度MIC；由获得的最低抑菌浓度MIC 测定伏立康唑的最低杀菌浓度MFC；6）制备烟曲霉菌生物膜载体A：早期模型建立 将步骤2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^‑1，将1~2ml孢子悬液放在步骤3）制备的载体上，静置于35~37℃生化培养箱中培养；培养24h时载体上为早期烟曲霉菌生物膜；B：成熟期模型建立 按照步骤A制备的烟曲霉菌生物膜培养48h时载体上为成熟期烟曲霉菌生物膜；7）药物对烟曲霉菌生物膜作用 将步骤6）制备的两种模型烟曲霉菌生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，后放入新的24孔板中，按步骤5）获得的绿原酸最低抑菌浓度MIC，加入亚抑菌浓度的绿原酸及最低杀菌浓度MFC的伏立康唑，每个孔加入量为1ml，空白组为MOPS缓冲的1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h，后取出载体，进行观察；8）XTT减低法测代谢活性  将配制好的维生素K₃溶液加入到XTT溶液中，使前者在XTT溶液中的终浓度为1‑2μmol/l；XTT减低法：用枪头吸取磷酸盐缓冲液轻轻冲洗步骤7）含有药物的烟曲霉菌生物膜载体表面浮游菌，放到新的24孔板内，吸取400~500μl XTT和维生素K3混合溶液加入到装有载体的孔内，于35~37℃避光静置2~4h，后吸取100~150μl孔内的XTT和维生素K3混合液，置于96孔酶标板中，在波长为490nm处测各孔OD值；9）荧光染液的配制a．取1ml无菌去离子水加入到1.5ml的避光离心管中；b．吸取2μl SYTO9染液加入到步骤a的避光离心管中；c．吸取2μl PI染液加入到步骤b的避光离心管中；d．用漩涡振荡器震荡此避光离心管30‑60s；e．将步骤d的避光离心管用离心机以2000rpm转速离心2~3min；10）荧光染色及观察  将步骤7）制备的烟曲霉菌生物膜载体置于无菌24孔板中， 再取100μl 步骤9）配制的荧光染液上清液滴加到载体上，35~37℃培养2h，再用荧光显微镜观察，此过程全程避光操作。