一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法

摘要

本发明提供了一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，该方法用丹参SmWRKY70转录因子构建重组的植物表达载体，遗传转化丹参叶片获得转SmWRKY70基因的丹参毛状根。本发明从丹参中分离克隆出789bp的SmWRKY70转录因子的编码框序列，并克隆了918bp的SmWRKY70转录因子的启动子序列；构建了SmWRKY70转录因子的亚细胞定位载体；构建了SmWRKY70基因的过表达载体，遗传转化丹参叶片获得SmWRKY70基因的过表达丹参毛状根。采用本发明的方法获得的转基因丹参毛状根中丹参酮含量显著提高，为生产具重要临床需求的丹参酮提供了一种新型优质药源，对缓解丹参酮药源的紧缺性起到积极的促进作用，具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

主权项

一种提高丹参毛状根中丹参酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因，分析其编码框序列，将丹参SmWRKY70转录因子基因插入植物表达载体，分别构建SmWRKY70基因的过表达载体；所述的丹参SmWRKY70转录因子基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)采用基因克隆方法获得丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列，所述丹参SmWRKY70转录因子基因的启动子序列如SEQ ID NO.2所示；(3)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，设计QRT‑PCR引物，对丹参SmWRKY70转录因子进行组织表达谱分析和诱导响应分析；(4)根据丹参SmWRKY70转录因子基因序列，构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草，对丹参SmWRKY70转录因子进行亚细胞定位分析；(5)将步骤(1)所获得的SmWRKY70基因的过表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；(6)将步骤(5)所获得的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根；(7)QRT‑PCR分析步骤(6)获得的经PCR检测为阳性的转基因丹参毛状根中SmWRKY70基因的表达，筛选出过表达SmWRKY70基因株系中SmWRKY70基因的表达量提高的株系；(8)用高效液相色谱法测定步骤(7)获得的过表达SmWRKY70基因株系中丹参酮的含量，筛选丹参酮含量提高的转基因丹参毛状根株系。