一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法

摘要

本发明提供一种根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化活性的质量控制方法，其是采用HPLC建立蜂胶指纹图谱，以高锰酸钾褪色时间、DPPH自由基清除率、磷钼酸结合率、羟基自由基清除率评价其抗氧化活性。通过分析蜂胶指纹图谱色谱及光谱特征确定25个特征峰及5个特征峰组。采用多项式拟合建立了根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化活性的数学模型。根据指纹图谱特征峰（组），仅采用本发明所提供的数学模型，不用做抗氧化试验即可直接判定蜂胶药材抗氧化活性的强弱，确定其质量的优劣。本发明具有方法简便、客观性强、特征峰多等优点，使蜂胶的质量控制更加完善和科学。

主权项

一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，通过建立蜂胶HPLC指纹图谱，根据HPLC指纹图谱特征峰识别，通过谱效数学模型直接判断蜂胶抗氧化作用的强弱；其步骤如下：1)建立蜂胶HPLC指纹图谱；供试品溶液：取蜂胶药材粉末，精密称定约1.0000g，置于索氏提取器中，以100mL丙酮索氏提取至无色，提取液水浴蒸干，残渣以甲醇溶解，置于100mL量瓶中，用甲醇定容至100mL刻度；色谱条件为：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为：A:甲醇，B：体积比浓度为0.4％的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式：0min→10min→20min→30min→38min→56min→67min→72min→79min→90min→98min→105min→109min→113min→120min,甲醇：35％→35％→45％→45％→50％→55％→55％→58％→60％→65％→69％→76％→87％→98％→98％，体积比浓度为0.4％的磷酸溶液：65％→65％→55％→55％→50％→45％→45％→42％→40％→35％→31％→24％→13％→2％→2％；流速：1mL/min,检测器：二极管阵列检测器；检测波长：283nm；柱温：25℃；进样量：15μL；2)提取特征色谱峰；提取特征色谱峰的特征峰保留时间分别为：3.7min、8.1min、13.9min、15.2min、17.1min、24.2min、35.5min、36.7min、40.2min、46.3min、58.9min、69.8min、71.9min、73.3min、74.5min、75.9min、78.2min、81.5min、84.7min、91.9min、93.5min、99.1min、102.4min、103.3min、104.3min25个特征峰,特征峰组保留时间分别为：46.3‑58.9min、58.9‑69.8min、84.7‑91.9min、93.5‑99.1min、99.1‑102.4min5个特征峰组；3)将2)步骤所识别特征峰和特征峰组峰面积代入谱效数学模型；X₁代表1号色谱峰峰面积，X₂代表2号色谱峰峰面积，X_n代表n号色谱峰峰面积,n位自然数；Z为所有共有特征峰和特征峰组峰面积之和，即Z＝X₁+X₂+X₃+X₄+X₅……X₃₀；高锰酸钾褪色时间与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型：Y_G＝Z/(‑9253990+2.06612X₂+4.38622X₃‑11.63460X₄‑3.54643X₆+1.54046X₇‑25.78130X₈‑2.62461X₉+0.41935X₁₂+1.69078X₁₃+5.07524X₁₄‑0.18923X₁₅+0.41898X₁₆‑1.06670X₁₇+3.32966X₁₈+4.26400X₁₉‑1.31022X₂₁‑0.34674X₂₂+2.00745X₂₃+10.47970X₂₄‑2.54667X₂₆+0.64201X₂₇+5.41115X₂₉)；其中，‑9253990为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2.06612为X₂对Y_G产生的贡献，+4.38622为X₃对Y_G产生的贡献，……+5.41115为X₂₉对Y_G产生的贡献，其中X₁的显著性检验P值大于0.05，所以X1的色谱峰被剔除；磷钼酸结合率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型：Y_L＝(3852360+2.35563X₁‑0.96533X₃‑2.76869X₄‑0.65365X₇+0.52339X₉+1.88828X₁₁+0.31946X₁₂+2.28396X₁₄‑0.40311X₁₅+0.17496X₁₆+0.58855X₁₈+1.33864X₂₁‑1.13913X₂₂+0.584843X₂₄+0.81001X₂₅+1.87709X₂₇+0.14703X₂₈+3.20671X₂₉‑3.89578X₃₀)*10^‑5；其中，3852360为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2.35563为X₁对Y_L产生的贡献，‑0.96533为X₃对Y_L产生的贡献，……‑3.89578为X₃₀对Y_L产生的贡献；羟基自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型：Y_Q＝(2594840+0.77370X₁+0.52682X₂‑0.66321X₃+0.29189X₅‑0.42388X₆+0.35545X₉+0.25710X₁₁+0.068273X₁₂+0.20390X₁₃+0.66739X₁₄‑0.19164X₁₆‑0.089679X₁₇‑0.40292X₁₉‑0.69228X₂₀+0.50906X₂₁‑0.036671X₂₂+1.04316X₂₃+0.24692X₂₄+0.25121X₂₅+0.21718X₂₆+0.29829X₂₇+0.30746X₂₈‑1.21455X₂₉‑1.37137X₃₀)*10^‑5；其中，2594840为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+0.77370为X₁对Y_Q产生的贡献，+0.52682为X₂对Y_Q产生的贡献，……‑1.37137为X₃₀对Y_Q产生的贡献；DPPH自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型：Y_D＝Z/(179117‑0.18890X₁+0.27095X₃‑0.46197X₄‑0.11349X₅+0.29916X₆‑0.83315X₈+0.030917X₉+0.028327X₁₂‑0.048098X₁₃‑0.0026432X₁₅+0.065066X₁₆+0.0070715X₁₈+0.0040330X₁₉‑0.039620X₂₁+0.035916X₂₃+0.24007X₂₄‑0.058539X₂₅+0.063668X₂₆+0.0065765X₂₇‑0.027835X₂₈+0.21152X₂₉‑0.00054146X₃₀)；其中，179117为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，‑0.18890为X₁对Y_D产生的贡献，+0.27095为X₃对Y_D产生的贡献，……‑0.00054146为X₃₀对Y_D产生的贡献；4)根据预测结果判定蜂胶质量优劣；高锰酸钾褪色时间Y_G为大于25s则此蜂胶样品为不合格品；高锰酸钾褪色时间Y_G大于15s且不超过25s的为劣质品，高锰酸钾褪色时间Y_G小于15s且大于0s的为优质品以数值较小者为佳；或对于合格样品磷钼酸结合率Y_L小于60％的为劣质品，磷钼酸结合率Y_L大于60％的为优质品以数值较大者为佳；或对于合格样品羟基自由基清除率Y_Q小于40％的为劣质品，羟基自由基清除率Y_Q大于40％的为优质品以数值较大者为佳；或对于合格样品DPPH自由基清除率Y_D小于65％的为劣质品，DPPH自由基清除率Y_D大于65％的为优质品以数值较大者为佳。