一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂

摘要

本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，筛选出鸭乙肝病毒Core区最大一致性的保守区核酸序列，以此为模板，设计、合成引物和荧光探针。构建pGEM-T/DHBV Core重组质粒，制备PCR标准品。通过优化反应体系和扩增条件。本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法具有通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，适于不同地区、不同鸭种的DHBV DNA的检测。

主权项

一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括标准品和PCR扩增体系；所述的标准品为pGEM‑T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM‑T载体中；所述的PCR扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～20mM Tris‑HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～50mM，下游扩增引物25～50mM，检测探针5～10mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10～20％；其中上游引物为：ggactcgaac ctagaaga；下游扩增引物为：ttatttccta ggcgaggg；检测探针为：accacagttg tctatgggag aag；所述的pGEM‑T/DHBV Core重组质粒中的DHBV Core区基因是以上游引物F1和下游引物R1对DHBV Core区基因进行PCR扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag；所述的扩增体系为25μl，包括：2×HotStart Taq PCR MasterMix 12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris‑HCl、pH8.3，100mM KCl和3mM MgCl₂；上游引物0.5μl、50mM；下游扩增引物0.5μl、50mM；检测探针0.5μl、10mM；DEPC‑H₂O 9μl；模板2μl。